新鮮冰凍血漿的病毒滅活方法及其應(yīng)用資料

1、新鮮冰凍血漿的病毒滅活方法及其應(yīng)用 新鮮冰凍血漿的病毒滅活方法及其應(yīng)用新鮮冰凍血漿（FFP）幾乎含有全部凝血因子，主要用于多種凝血因子缺乏伴有嚴(yán)重貧血的患者，也用于大量失血或凝血試驗(yàn)異常而需要施行侵入性操作的患者以預(yù)防出血。雖然對FFP 供者進(jìn)行了嚴(yán)格的篩選和實(shí)驗(yàn)室病毒檢測，但經(jīng)血傳播病毒的危險性仍然存在，原因在于：1）檢測方法靈敏度有限；2）“窗口期”問題；3）新病毒的出現(xiàn)；4）目前我國檢測病毒的種類僅為 HIV1/2、HBV、HC

2、V；因此，檢測結(jié)果陰性并不能排除病毒感染的可能。據(jù)估計，輸用血漿的危險程度為 10 000 U 可發(fā)生 75 次不良反應(yīng)，每 1 000 名患者有 37 起不良反應(yīng)發(fā)生。1 項(xiàng)研究在分析了 48 年來應(yīng)用未經(jīng)病毒滅活血漿和經(jīng)病毒滅活血漿后發(fā)生不良反應(yīng)需要救治的花費(fèi)，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用病毒滅活血漿至少每年為美國節(jié)約 200 萬美元，如果考慮非感染性并發(fā)癥，如輸血相關(guān)性急性肺損傷（TRALI），可以為英國每年節(jié)約 5 萬英鎊［1］。目前歐洲各國都已

3、禁止使用未經(jīng)病毒滅活的血漿，國內(nèi)應(yīng)用 FFP 非常廣泛，但病毒滅活尚未普遍進(jìn)行。目前國內(nèi)外幾種病毒滅活技術(shù)正在臨床應(yīng)用，血漿成分及其衍生物主要采用有機(jī)溶劑去污劑法（SD）和亞甲蘭加可見光法（MBR）,補(bǔ)骨脂素加光照血漿（PLT）已經(jīng)在歐洲應(yīng)用。核黃素加光照（PRT）對血漿、紅細(xì)胞和血小板 3 種成分中的病毒可能均有滅活作用，但仍處于研發(fā)階段；除 SD 法外其它滅活劑的作用都是針對病毒核酸的［2］。現(xiàn)就血漿病毒滅活的方法和應(yīng)用作一簡介。1

4、 SD 法1.1 滅活方法 SD 法由紐約血液中心發(fā)明，通常用磷酸 3N 丁酯（TNBP）和吐溫-80 或膽酸鈉，二者協(xié)同作用可以溶解和去除病毒的脂包膜而使其滅活。SD 法處理血漿是將＜2 500人份的同型、融化的 FFP 混合與 1％TNBP 和 1％去污劑 TritonX100，在 37℃孵育 4h，用蔬菜油浸出液萃取之后，用 C18 層析柱清除溶劑和去污劑。由此制備的血漿經(jīng)無菌過濾，200ml 分裝，再次于-30℃冰凍保存。

5、該法約使血漿稀釋 10 倍，殘留的微量 TNBP(1.2 優(yōu)點(diǎn) SD 通過破壞脂包膜病毒外膜結(jié)構(gòu)的完整性或靶細(xì)胞受體識別位點(diǎn)，使之喪失感染性，故對脂包膜病毒有較好的滅活效果。國外評價了幾種病毒滅活方法后都認(rèn)為，SD 法對含脂包膜病毒的滅活效果最好，如 HBV、HCV 和 HIV［3,4］。實(shí)驗(yàn)表明 SD 處理可使黑猩猩感染 HBV 和 HCV 的劑量（CID50）分別減少 106 和 l05 以上，使組織培養(yǎng)感染 HIV 的劑量(TCI

6、D50)減少 106 以上。SD 法能有效殺滅非典型性肺炎（SARS）冠狀病毒，但對非脂包膜病毒如 HAV 和 B19 病毒無滅活作用。研究證實(shí)經(jīng) SD 處理后的血漿蛋白質(zhì)量合格，制備技術(shù)簡單，有利于大規(guī)模生產(chǎn)和臨床應(yīng)用［5］，且不會導(dǎo)致紅細(xì)胞溶血，不會影響血小板的形態(tài)及功能。研究還證實(shí) SDP 中凝血因子和蛋白抑制因子（PI）在凍溶后 4℃保存 8h 或常溫保存 6h 均較穩(wěn)定，融化后除了蛋白 S（PS）外，所有凝血因子和 PI 的活

7、性在融化后 4℃儲存 6d 至少還有 05 IU/ml［6］，保持了較高的質(zhì)量，應(yīng)用效能和安全性也沒有因?yàn)?PS 和纖維蛋白抑制因子活性降低而受到限制。SDP 混合后可通過血漿抗體和過敏原的中和作用消除 TRALI，也可明顯減少過敏反應(yīng)的發(fā)生，并可移除殘余的血細(xì)胞、細(xì)胞碎片和細(xì)菌，移除血管性血友病因子（vWF）等大分子物質(zhì)。從質(zhì)量角度而言，SDP 匯集易于標(biāo)準(zhǔn)化，且易于過程質(zhì)量控制，同一批中的各種凝血因子、纖維蛋白原(Fg)及總蛋白含

8、量都是相同的，能給出準(zhǔn)確含量，易于臨床參照使用。1 份研究報告顯示，2×106U 的 SDP 和 11×106U經(jīng) SD 處理的血液制品輸用后，尚未見發(fā)現(xiàn)病毒傳播。因此認(rèn)為 SDP 對臨床使用有實(shí)際意義，適合大多數(shù)患者選擇應(yīng)用。1.3 缺點(diǎn) SD 法處理血漿后對凝血因子活性影響很大，Doyle 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng) SD 處理后，血漿 FⅤ、FⅧ和 PS 分別下降 31%、28%和 50%；而 Heger 等［6］研

9、究 SDP 在凍溶后 4℃保存 8h 或常溫保存 6h 后的凝血因子活性，發(fā)現(xiàn) FⅨ、FⅩ、FⅪ、FⅫ、vWF:Ag、Fg用效果肯定，未見副作用。MBR 法具有高效、安全、簡便、毒性低等特點(diǎn)，可大大降低因輸血造成的病毒傳播，比較適用于我國血站系統(tǒng)。2.3 缺點(diǎn) 研究發(fā)現(xiàn)采用高濃度 MBR 和延長光照時間處理血漿后，大多數(shù)血漿蛋白都有復(fù)雜的改變，包括纖維蛋白 γ 鏈、甲狀腺激素結(jié)合蛋白和載脂蛋白 AⅠ，因此應(yīng)用 MBR 時濃度要嚴(yán)格限制

10、［14］。有研究對 MBR 處理 10 份 A 型血漿后進(jìn)行評估，凝血因子的損失程度為：Fg 23%，F(xiàn)Ⅴ10%，F(xiàn)Ⅷ 26%，F(xiàn)Ⅸ 11%和 FⅪ 13%［13］。而 Aznar 等［15］研究發(fā)現(xiàn) MBP 凝血因子的活性平均喪失 25％，其中 FⅧ 29％，F(xiàn)g 39％，F(xiàn)Ⅹ Ⅲ16％，vWF 18％。vWF 活性喪失明顯低于 FⅧ。用 MBRP 和冷沉淀對血管性血友病和 FⅩ Ⅲ和 Fg 缺乏癥患者有一定的影響。MB 和紅光處理血

11、漿對血漿的聚合凝結(jié)有影響，形成結(jié)構(gòu)更為緊密的纖維凝塊，但對纖維蛋白形成凝塊的穩(wěn)定性或纖溶沒有影響［16］。雖然經(jīng) MB 處理和過濾后血漿 FⅧ和 FⅨ喪失 15％，光照進(jìn)一步導(dǎo)致 10％—15％的其它凝血因子喪失，F(xiàn)Ⅷ和 vWF回收率降低，但是不影響冷沉淀的制備［17］。MBR 處理后的冷沉淀喪失最多的是 FⅧ (23%)，其次是 Fg、FⅩ Ⅲ 和瑞斯托霉素輔因子活性（vWF：RCo），分別是 18%、14%和13%，vWF：Ag 的

12、喪失最小，僅 3％, 對凝血系統(tǒng)的抑制因子很受有影響。經(jīng) MBR 處理后，F(xiàn)g 濃度有輕微減少，活性卻下降 31％，纖維蛋白的聚合指數(shù)僅有輕微的改變，在 MBRF 后也沒有明顯的改變；TT 延長了 6s，經(jīng) MBRF 后沒有進(jìn)一步的改變。這種體外的改變類似于纖維蛋白功能失調(diào)患者的血漿改變，但通常沒有明顯的臨床癥狀［18］。 MBR 法對非脂包膜病毒，如 HAV、B19 等無效。另外，由于 MBRP 中各種凝血因子含量和總蛋白含量非標(biāo)準(zhǔn)化

13、，所以臨床使用無準(zhǔn)確參考劑量。2.4 臨床應(yīng)用 MBRP 的適應(yīng)證同 FFP。MBRP 及由其制得的冷沉淀均是臨床無病毒傳播的有效制品，可安全地治療血管性血友病，F(xiàn)Ⅹ Ⅲ和 Fg 缺乏癥等。應(yīng)當(dāng)指出，MBRP 不能用于血漿擴(kuò)充和蛋白支持療法。MB冷上清（經(jīng) MB 處理后的 FFP，制備冷沉淀后上清液）可以用于治療血栓性血小板減少性紫癜，糾正全部或者部分凝血酶原復(fù)合物缺陷，特別是 FⅤ 和 FⅪ不足［19］。3 S59 及光化學(xué)處理法

14、 及光化學(xué)處理法用補(bǔ)骨脂內(nèi)酯衍生物 S59 進(jìn)行光化學(xué)處理血漿(PCTFFP)已經(jīng)發(fā)展成為輸血應(yīng)用中滅活血漿中病原體和白細(xì)胞的重要方法。Singh 等［20］用 150μmol/L S59 加 3J/ cm2 的長波紫外線照射含病毒模型血漿，發(fā)現(xiàn)處理后血漿病毒滅活水平有對數(shù)級減少：HIV1＞68/64Log、HTLVⅠ為 45Log、HTLVⅡ＞57Log、HBV 和 HCV＞45Log、SARS 為 55Log

15、、西尼羅病毒為68Log；對部分細(xì)菌、原蟲、螺旋體等也有很強(qiáng)的殺滅作用。Fg 和 FⅧ降低到原來水平的72％—73％，F(xiàn)Ⅱ、FⅤ、FⅦ、FⅨ、FⅩ、FⅪ、FⅩ Ⅲ、PC、PS、AT 和 α抗纖維蛋白酶基本不變，說明 PCTFFP 有廣譜滅活病原微生物的作用，并且能夠保留充足的凝血因子，可以應(yīng)用于臨床。先天性凝血因子 (FⅠ、FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅩ、FⅪ、FⅩ Ⅲ和 PC) 缺乏和獲得性凝血功能障礙性出血的患者用 PCTFFP 治

16、療，效果與 FFP 一樣［21,22］。有研究對S59 加 A 段紫外光和 MB 加可見光兩種病毒滅活的方法，在 3 個時間點(diǎn)（處理后立即測定、冷凍儲藏 30d 后和 4℃融化后 24h）測定了凝血因子活性，結(jié)果顯示：在 PCTFFP 和MBRP 中 FⅡ、FⅫ、FⅩ Ⅲ、vWF:Ag、ADAMTS13（血管性血友病因子裂解酶）、DD 和 PC均相等，在 PCTFFP 中 PT、APTT 縮短，而在 MBRP 中 TT、Fg、F

17、Ⅺ和 PS 更高，在 PCTFFP中 FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅩ、vWF 和 vWF：RCo 相等或更高于在 MBRP 中，在 MBRP 中的纖溶酶原、AT 和血纖維蛋白溶酶抑制物則高于在 PCTFFP 中。總體上來說，PCTFFP 的凝血因子水平和穩(wěn)定性比 MBRP 更好［23］。S59 及光化學(xué)處理可用于血漿、血小板中病毒，細(xì)菌等病原微生物及白細(xì)胞的滅活，不利之處是不能用于紅細(xì)胞制品的滅活，經(jīng) S59 處理后的血液，需用特殊儀