滅活劑和佐劑

1、滅活劑和佐劑,第一節(jié) 滅活劑,滅活是生物制品中的一項(xiàng)非?；炯夹g(shù)?。?！ 提高生物制品的安全性防止病原體擴(kuò)散,一、滅活與滅活劑,（一）什么是滅活？,微生物學(xué)意義上滅活有兩層含義：1、是指破壞或殺死微生物使其成為沒有生命物質(zhì)的過程。2、生物制品上的滅活還有滅能的含義，是指將一些活性物質(zhì)（微生物及其代謝產(chǎn)物、激素、酶、血清因子和抗體等）喪失活力的過程。例如：經(jīng)過56度加熱30分鐘處理，可破壞診斷血清和待檢血清中的補(bǔ)體活性，從而避免補(bǔ)體

2、對診斷的干擾作用。,生物制品意義上滅活的含義：是利用物理或化學(xué)的方法，破壞微生物的生物學(xué)活性，破壞病原微生物的繁殖能力和致病能力，但仍然保留反應(yīng)原性和免疫原性的過程。,（二）滅活的類型,按照滅活作用的性質(zhì)可分為兩類：1.物理滅活2.化學(xué)滅活,1、物理滅活,熱滅活：容易發(fā)生菌體蛋白質(zhì)變性超聲波滅活：應(yīng)放在冰浴中間斷進(jìn)行紫外線滅活：不夠好射線照射滅活：根據(jù)被照射物的容量大小選擇照射距離和照射強(qiáng)度。,2、化學(xué)滅活,利用化學(xué)藥品等使

3、微生物、活性物質(zhì)的某些某些結(jié)構(gòu)位點(diǎn)發(fā)生改變，從而喪失生命力、感染性、毒性或活性。效能常受滅火劑種類、劑量和作用溫度、pH、時(shí)間等因素的影響，使用時(shí)必須篩選最佳的滅活條件。方法簡單、效果確實(shí)、最為常用。,（三）滅活劑,用于滅活微生物的化學(xué)試劑或藥物1911年，Lowenstein DH用甲醛處理破傷風(fēng)毒素而制成類毒素 1924年，Puntoni以苯酚或甲醛處理制成犬瘟滅活苗1934年，Morion Dorset等用結(jié)晶紫滅活豬瘟

4、病毒制成豬瘟結(jié)晶紫疫苗。,是最古典、使用最廣泛的滅活劑《獸醫(yī)生物制品制造及檢驗(yàn)規(guī)程》（2000）中的26種滅活疫苗，均以甲醛作為滅火劑。,二、常用滅活劑的滅活機(jī)理與應(yīng)用,1、甲醛,甲醛的水溶液——福爾馬林 (含甲醛36~40%) 滅活機(jī)理：還原作用,氨基 甲基胺,羧基 亞甲基二醇單酯,巰基 亞甲基二醇,甲醛 醛基,羥基 羥基甲

5、酚,,,,,,,,滅活濃度：需氧細(xì)菌0.1％～0.2％，厭氧細(xì)菌0.4％～0.5％，病毒0.05％～0.4％。 滅活原則：低濃度、短時(shí)間而又能達(dá)到徹底滅活目的。 必要時(shí)可在滅活后加入焦亞硫酸鈉，以中斷其反應(yīng)。,N-乙酰乙烯亞胺（AEI)、二乙烯亞胺(BEI) 、縮水甘油醛（GDA）滅活機(jī)制： 1. 烷化DNA分子中的鳥嘌呤或腺嘌呤等，引起單鏈斷裂或雙螺旋鏈交聯(lián)，因改變DNA的結(jié)構(gòu)而破壞其功能，妨

6、礙RNA的合成，從而抑制細(xì)胞的有絲分裂。 2. 與酶系統(tǒng)和核蛋白起作用而干擾核酸代謝。,2. 烷化劑（Alkylating agent）,優(yōu)點(diǎn)：能破壞病毒的核酸芯髓，使病毒完全喪失感染力，而 不損害其蛋白衣殼，保留其保護(hù)性抗原。,（1）N-乙酰乙烯亞胺（AEI）淡黃色澄明液體，有輕微氨臭味，能與水或醇任意混合。0～4℃可保存1年，在-20℃可保存2年。AEI功能基團(tuán)是乙烯亞胺基，可用于口蹄疫滅活苗?？谔阋卟?/p>

7、毒液: 終濃度0.05％，30℃8h, 加2％硫代硫酸鈉阻斷,（2）二乙烯亞胺（BEI）市購商品為0.2％的BEI溶液，在0～4℃可保存1個(gè)月;口蹄疫病毒懸液：終濃度0.02%, 加入2％硫代硫酸鈉中斷滅活。,大腸桿菌、噬菌體、新城疫病毒滅活效果優(yōu)于甲醛。本品易揮發(fā)，水溶液含量為15～31mg/ml。0～4℃ 保存3個(gè)月后含量漸下降，約半年失效；20℃只能保存10 d。,（3）縮水甘油醛（GDA）,3. 苯酚,又稱石碳酸。有腐蝕

8、性，而且有毒！易溶于水及有機(jī)溶劑。滅活機(jī)制：使微生物蛋白質(zhì)變性和抑制如脫氨酶、氧化酶等酶系統(tǒng)的活性，從而導(dǎo)致微生物死亡。通常：生物制品的常用量為0.3%-0.5%, 另外，芽孢、真菌和病毒對苯酚的耐受性很強(qiáng)。,4. 結(jié)晶紫,是甲基紫、龍膽紫的純品。滅活機(jī)制：是結(jié)晶紫陽離子與微生物蛋白質(zhì)帶陰性電荷的羧基形成弱電離的化合物，從而干擾微生物正常代謝和氧化還原作用，主要干擾細(xì)胞壁肽聚糖的合成，導(dǎo)致革蘭氏陽性菌生長繁殖受阻。,5. β-丙內(nèi)

9、酯,又名丙內(nèi)酯。滅活機(jī)制：破壞病毒的核酸芯，但不損壞衣殼蛋白，因此保護(hù)性抗原成分得以保留，主要用于狂犬病滅活苗的制備。然而研究表明，丙內(nèi)酯是一種潛在的致癌因子。,6. 硫柳汞,常用做生物制品的防霉和消毒劑，對霉菌、細(xì)菌和病毒都有一定的滅活作用，百日咳菌苗作為滅火劑。 常用濃度為0.01%-0.02%。,1、滅活劑特異性：如石炭酸對真菌和病毒效果差，但對細(xì)菌效果好。結(jié)晶紫能殺死多種革蘭氏陽性菌和陰性菌，但對綠膿桿菌和細(xì)胞芽孢作用弱。

10、2、微生物種類和特性：,三、影響滅活作用的因素,3、滅活劑濃度（一定要適合）4、滅活溫度：通常同一濃度的滅活劑在不同溫度的滅活速度與溫度成正比，但溫度太高，對微生物的抗原性將有不利影響。（具體不同病原體或毒素，其滅活時(shí)間和溫度不一致）。,5、滅活時(shí)間：一般采用低濃度、低溫和短時(shí)間處理為最佳。6、滅活pH值：7、微生物含氮量：一般微生物或毒素的總氮量和氨基氮含量越高，滅活劑的消耗量就越大、滅活脫毒越慢。8、有機(jī)物存在：,第二節(jié)

11、佐劑,佐劑是免疫學(xué)和生物制品學(xué)中的一個(gè)重要內(nèi)容,對增強(qiáng)機(jī)體對抗原的免疫應(yīng)答，提高生物制品的免疫效應(yīng)發(fā)揮著重要作用,什么是 “佐劑”呢？,1. 佐劑（新概念）：凡是可以增強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)均稱為佐劑。 佐劑（舊概念）：當(dāng)一種物質(zhì)先于抗原或與抗原混合或同時(shí)注射于動(dòng)物體內(nèi)，能非特異性地改變或增強(qiáng)機(jī)體對該抗原的特異性免疫應(yīng)答,發(fā)揮其輔佐作用的物質(zhì)。 也稱免疫佐劑、抗原佐劑。注意: 佐劑和免疫增強(qiáng)劑的關(guān)系?,一、佐劑概

12、念與作用特點(diǎn),① 明顯增強(qiáng)抗原性微弱的物質(zhì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。② 用最少的抗原和最少的接種次數(shù)，產(chǎn)生足夠的免疫應(yīng)答。,作用特點(diǎn)：,二、 研究歷史,1、起始階段,1916年Moignar最早用羊毛脂與石蠟油制成傷寒沙門氏菌乳劑苗；繼后Prevet用羊毛脂加瓊脂為佐劑制出炭疽菌苗。 1925年，Gaston Ramon證明了明礬的佐劑作用。,2、1950年代,為提高獸醫(yī)生物制品的免疫效果，在獸醫(yī)領(lǐng)域?qū)ψ魟┻M(jìn)行了廣泛的研

13、究。,用氫氧化鋁膠吸附再加油佐劑制成的豬丹毒菌苗，免疫乳豬后的免疫力可持續(xù)9個(gè)月，比鋁膠佐劑苗提高1倍。,3、1960年代以后,礦物油佐劑的研究發(fā)展迅速,布氏桿菌油佐劑苗（1966） 魏氏梭菌油佐劑苗（1966） 流感油乳劑苗（1977）） 禽支原體+新城疫油乳劑二聯(lián)（1978） 鏈球菌+葡萄球菌乳劑二聯(lián)苗（1984）,4、我國的佐劑的研究,佐劑的研究和佐劑苗的生產(chǎn)，始于1950年代。,1958年曾用羊毛脂和液體石蠟油制造豬丹毒

14、油乳劑苗，但效果不理想。 1980年代以來，對白油佐劑的研究和應(yīng)用發(fā)展極快，尤以禽病白油佐劑疫苗的種類更多，使用效果也比較滿意。,WHO認(rèn)為佐劑除具有免疫增強(qiáng)效應(yīng)外，尚必須具備下列標(biāo)準(zhǔn)，否則不得用作佐劑。,三、佐劑標(biāo)準(zhǔn),1、無致癌或輔助致癌性,不能誘導(dǎo)或促進(jìn)腫瘤形成。,2、安全無毒性,通過肌肉、皮下、靜脈、腹腔、滴鼻、口服等各種途徑進(jìn)入動(dòng)物體后無任何副作用。,3、純度高、雜質(zhì)少,雜質(zhì)往往是副作用的誘發(fā)物。因此，佐劑必需符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。,

15、4、應(yīng)有一定的吸附力 最好吸附力強(qiáng),5、在動(dòng)物體內(nèi)易降解 不宜長時(shí)期留存而誘發(fā)組織損傷,6、不含與動(dòng)物有交叉的抗原 以避免誘發(fā)自身免疫反應(yīng)，防止發(fā)生自身免疫性疾病。,7、不應(yīng)誘發(fā)自身超敏性 也不應(yīng)與抗體結(jié)合形成有害的免疫復(fù)合物。,8、應(yīng)性質(zhì)穩(wěn)定 佐劑抗原混合物儲(chǔ)存1年以上，必須不分解、不變質(zhì)和不產(chǎn)生不良物質(zhì)。,四、免疫佐劑作用機(jī)理,① 改變正常免疫機(jī)能，吸引大

16、量巨噬細(xì)胞以吞噬抗原；② 改變抗原的構(gòu)型，使抗原物質(zhì)降解，并加強(qiáng)其免疫原性；③ 延長抗原在組織內(nèi)的貯存時(shí)間，使抗原緩慢降解和緩釋，并發(fā)揮免疫系統(tǒng)的細(xì)胞間協(xié)同作用（巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞，T細(xì)胞與B細(xì)胞）。,作用方式,① 抗原遞呈（antigen presentation） ② 抗原尋的（antigen targeting）③ 免疫調(diào)節(jié)（immune modulation）,作用機(jī)理,①抗原遞呈： 指抗原分子遞呈給T細(xì)胞的方法。佐

17、劑與疫苗聯(lián)合使用，有助于抗原性物質(zhì)在胞內(nèi)被加工，被MHC分子特異性的結(jié)合、保護(hù)、運(yùn)輸并遞呈給效應(yīng)細(xì)胞。,② 抗原尋的（antigen targeting） 指抗原傳遞給免疫系統(tǒng)中適當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞的效率。包括吸引巨噬細(xì)胞到達(dá)組織部位、活化吞噬細(xì)胞、促進(jìn)抗原與細(xì)胞受體的結(jié)合等。,③ 免疫調(diào)節(jié)（immune modulation） 是指任何可以修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞對抗原或表位進(jìn)行加工的機(jī)制。通過這種機(jī)制，可以改變特異性免疫應(yīng)

18、答的本質(zhì)或強(qiáng)度。T細(xì)胞有Th1和Th2兩個(gè)亞類。同一抗原和不同佐劑一起使用能夠引起不同的免疫反應(yīng)。因此，通過篩選特定的佐劑，可以達(dá)到誘導(dǎo)正確的免疫應(yīng)答的目的。,1. 按佐劑物理性質(zhì) 顆粒型佐劑 非顆粒型佐劑2. 按佐劑的生物學(xué)性質(zhì)（即Ballanti分類法） 微生物及其組分佐劑 非微生物物質(zhì)佐劑3. 按佐劑在體內(nèi)存留的時(shí)間 貯存型佐劑（depot type adjuvant） 非貯存型佐劑（non-depot

19、 type adjuvant）,五、佐劑的分類,六、常見的獸用免疫佐劑,1、礦物質(zhì)類佐劑 礦物質(zhì)佐劑是傳統(tǒng)佐劑中的一類。 在獸用疫苗的制備中廣泛使用。,,氫氧化鋁膠,磷酸鋁膠,特點(diǎn) ?主要誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，可刺激機(jī)體迅速產(chǎn)生持久的高抗體水平。 ?比較安全。,缺點(diǎn) ?皮下注射時(shí)常有腫脹或結(jié)塊；?不能有效刺激保護(hù)性T細(xì)胞免疫。,2、油類佐劑,主要有,弗氏佐劑,弗氏不完全佐劑,弗氏完全佐劑

20、,白油佐劑,,,是指一類由油類物質(zhì)、水溶液和乳化劑按一定比例混合形成的佐劑。 該類佐劑主要在抗原尋的過程中起作用，使抗原在注射部位保持穩(wěn)定，為抗原在淋巴系統(tǒng)中轉(zhuǎn)運(yùn)提供載體，增加單核細(xì)胞的形成和積聚。 油乳劑疫苗的免疫效力高低，直接與乳化作用的好壞及油、乳化劑質(zhì)量有關(guān)。,油乳佐劑,分為,單相乳化佐劑,雙相乳化佐劑,,單相乳化佐劑,（1）油包水（ W/O） 較粘稠，在機(jī)體內(nèi)不易分散；但佐劑活性

21、優(yōu)良，為生物制品所采用的主要?jiǎng)┬?（2）水包油 （O/W） 較稀薄，在機(jī)體內(nèi)易于分散；但佐劑活性很低，生物制品中不采用。,雙相乳化佐劑,又分為水包油包水和油包水包油 型,粘度小，注射局部反應(yīng)輕微， 易吸收和佐劑效應(yīng)高,一種液體或粉末微粒（分散相或內(nèi)相）借助乳化劑、機(jī)械力的作用，分散懸浮于另一種不相溶的液體（連續(xù)相或外相）中從而形成穩(wěn)定的分散體系。,油乳佐劑原理,乳化劑,指油乳劑中內(nèi)相與外相間的界面活性物質(zhì)，具有促進(jìn)和

22、穩(wěn)定兩種互不相溶物形成乳劑。,如羊毛脂、Span-80、Arlacel-80、Tween-80、AtlsG-1471等。,乳化原理,降低分散物的表面張力，在微滴表面上形成薄膜或雙片層，以阻止微滴(粒)的相互凝結(jié)。,佛氏不完全佐劑,是由低引力和低粘度的礦物油及乳化劑組成的一種貯藏性佐劑。,佛氏完全佐劑,在不完全佐劑的基礎(chǔ)上加一定量的分支桿菌而成。,雖然具有一定的副作用，但其佐劑活性是其它物質(zhì)難于相比的。,佛氏佐劑的特點(diǎn),可使在正常狀態(tài)下缺

23、乏免疫原性的物質(zhì)成為免疫原。 先作用于Th1細(xì)胞，后是Th2細(xì)胞，并能啟動(dòng)細(xì)胞免疫而發(fā)揮作用。,國外常用白油：Drakocel-6VR、Marcol-52和Lipolul-4國內(nèi)常用白油：7號或10號白油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn): 無色無味； 50℃運(yùn)動(dòng)粘度7m2／s左右； 紫外吸收值（250-350）＜0.1％，紫外消光系數(shù)＜12×108； 單環(huán)芳烴與雙環(huán)芳烴含量低于0.5％，無多環(huán)芳烴； 小鼠腹腔注射0.5ml 觀察16

24、0d 或家免皮下注射2.0ml白油觀察60d，表現(xiàn)正常。,白油佐劑,（1）劑在水中法： 將乳化劑直接溶于水中，在激烈攪拌下將油加入，可直接生成O/W乳劑。若欲得W/O型，可繼續(xù)加入油，直到發(fā)生變型。該法通常用勻漿器或膠體磨，高速攪拌而得到較好的乳劑。,油乳佐劑乳化方法,（2）劑在油中法： 將乳化劑溶于油相，將油相直接加入水相中得O/W，如水相直接加入油相，得到W/O型，如欲得O/W，繼續(xù)加入至變型。該法制

25、成的乳劑，一般均勻顆粒直徑在0.5µm左右，比較穩(wěn)定。,免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用的佐劑配制: (1)弗氏佐劑：礦物油75%~85％，乳化劑15％~25%，混合后經(jīng)除菌過濾而成為FIA；如向其中加入0.5mg／m1死結(jié)核桿菌即為FCA。使用時(shí)，將含抗原的水相，與上述任一佐劑等量混合，用力振搖即可成為均勻的乳劑。(2) 白油佐劑：9份油和1份Span-80混合后加2％Tween-80和1％~2%硬脂酸鋁，經(jīng)高壓滅菌后備用，注射前將配好的

26、油佐劑與抗原水相1：1混合，強(qiáng)力振搖，可配制成性狀良好的乳劑疫苗。,大量生產(chǎn)白油乳劑疫苗: 油相: 94％白油、6％Span-80、1%~2％硬脂酸鋁，滅菌即可； 水相：抗原液加2％~4% Span-80; 乳化：將油相與水相按3：1~2：1比例配制，先緩速混合，再通過膠體磨充分乳化，可獲得穩(wěn)定的油包水乳劑苗?；蛘邔⒄吵淼腤/O乳劑疫苗，再加2％ Tween-80 生理鹽水，通過攪拌或膠體磨乳化，可制成雙相乳劑疫苗。,（1）粘度測

27、定：流出法、Saybolt粘度計(jì)法吸管內(nèi)口直徑為1.2 mm，室溫下吸滿l ml乳劑，垂直放出0.4 ml所需時(shí)間作為粘度單位。以 2-6 S為合格，不得多于10-15 S。（2）乳劑穩(wěn)定性測定：① 加速老化法：疫苗于37℃貯存10-30 d不破乳。② 離心加速分層法：于半徑10 cm離心管裝油乳劑，3000 rpm離心15 min不分層，相當(dāng)于保存1年以上不破乳。,油乳佐劑檢驗(yàn),3、蜂膠佐劑,是一種優(yōu)良的天然藥物； 具有廣泛

28、的生物活性和藥理作用（抗菌、抗病毒、抗腫瘤、消炎）； 具有免疫增強(qiáng)作用：能保持抗原特性，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，促進(jìn)抗體的產(chǎn)生，提高機(jī)體的特異性和非特異性免疫力。,（1）蜂膠的處理： 蜂膠（4℃以下貯存） 粉碎過篩 按1：4（W/V）加95％乙醇 室溫浸泡24～48h 冷卻 過濾或離心取上清 透明栗色純凈蜂膠浸液 4℃以下保存?zhèn)溆?除去干渣計(jì)算出浸液

29、中含蜂膠量。（2）蜂膠佐劑疫苗的制備： 滅活菌液或病毒液，加入蜂膠乙醇浸液，使每毫升菌液中含蜂膠10mg，邊加邊搖蕩，成為乳濁狀，即可。,,蜂膠佐劑疫苗制備方法：,,,,,,,1、細(xì)胞因子類佐劑,細(xì)胞因子的概念 是機(jī)體的各種細(xì)胞在其生命周期中所釋放的具有不同生物學(xué)效應(yīng)的物質(zhì)，是免疫細(xì)胞間相互作用的調(diào)節(jié)信號。該類物質(zhì)相互誘生，相互影響，構(gòu)成一個(gè)巨大的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)（cytokine network）系

30、統(tǒng)，各種細(xì)胞借助自己所釋放的細(xì)胞因子完成各自的功能，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用。,七、新型佐劑,細(xì)胞因子的分類（根據(jù)生物活性）經(jīng)典的細(xì)胞因子： 淋巴毒素（LT）、腫瘤壞死因子（TNF）、干擾素（INF）2. 對體液免疫和細(xì)胞免疫具有調(diào)節(jié)作用的因子： 白細(xì)胞介素（IL）和集落刺激因子（CSF）,1．作為免疫佐劑，提高疫苗的免疫效果2．作為免疫治療劑，預(yù)防和治療某些病原感染3．通過基因重組，構(gòu)建新型基因工程疫苗

31、 IL-2-AIV-HA重組痘病毒,細(xì)胞因子的應(yīng)用,幾種重要的細(xì)胞因子,白細(xì)胞介素-2（IL-2） 白細(xì)胞介素-4（IL-4） 白細(xì)胞介素-12（IL-12） γ -干擾素（IFN-γ）,刺激物為抗原或促有絲分裂原（ConA）； T細(xì)胞分泌； 無抗原特異性。 糖蛋白，含133aa ，分子量15-35kDa； 70℃ 30 min及pH值2-9范圍內(nèi)穩(wěn)定。,IL-2,刺激物：抗原或絲裂原；由Th細(xì)胞產(chǎn)生分子量15

32、～20kDa，有2～3個(gè)糖基化部位，140個(gè)氨基酸一種強(qiáng)有力的佐劑候選因子,IL-4,是目前發(fā)現(xiàn)的唯一主要由B細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，與IL-2有協(xié)同作用，所以曾被稱為細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞成熟因子（CLMF）和天然殺傷細(xì)胞刺激因子（NKSF）。 糖蛋白，分子量75kDa，由40kDa（P40）和35kDa（P35）兩個(gè)亞單位構(gòu)成，兩個(gè)亞單位完全由不同的基因所編碼，只有結(jié)合為一個(gè)完整的分子時(shí)才能發(fā)揮生物學(xué)活性。 IL-12活性高于IL-2和I

33、FN，在極低濃度時(shí)就有顯著活性，對滅活疫苗、腫瘤和寄生蟲抗原具有有效的佐劑活性。 IL-12誘導(dǎo)產(chǎn)生的Th1應(yīng)答反應(yīng)尤為引人注目，可望用于主要誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的疫苗佐劑。,IL-12,由致敏T細(xì)胞在活的或滅活的病毒等干擾素誘生劑和某些細(xì)胞因子作用下所產(chǎn)生； 有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和免疫佐劑等免疫生物學(xué)活性。 主要誘導(dǎo)MHC-II的表達(dá)。 目前IFN-γ與抗原雜合的融合分子的研究是個(gè)熱點(diǎn)，期待其成為一個(gè)有效的佐劑。,IFN-

34、γ,2、CpG DNA,CpG DNA：指含有非甲基化CpG（胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸）基序的脫氧核糖核酸DNA。 CpG基序（ motif）：指以非甲基化的CpG為基元構(gòu)成的回文序列，其堿基排列大多為5′-Pur-Pur-CpG-Pyr-Pyr-3′，具有較強(qiáng)免疫活性，稱為免疫刺激序列（ISS，immunostimulatory DNA sequences）。 CpG OND：含有非甲基化CpG基序的寡聚脫氧核苷酸 。,細(xì)胞因子

35、的分泌和細(xì)胞的分化,CpGDNA的免疫刺激效應(yīng)（作用機(jī)制）,,,,溫度\能量,,,酸化內(nèi)體小泡,,,,,,,,,,,,,,,,,,DNA-PK,TLR-9,胞質(zhì)內(nèi)受體蛋白,有絲分裂原蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子等信號通路,,,,,引起B(yǎng)細(xì)胞分化，分泌IL-6、IL-10等細(xì)胞因子和表達(dá)MHCII、B7-1、B7-2等表面分子，并阻止B細(xì)胞的凋亡。 直接激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞，分泌IL-12、INF-r等Thl樣為主的細(xì)胞因子，并刺激

36、MHCII、B7-1、B7-2的表達(dá)。,CpG DNA對多種免疫細(xì)胞有激活作用,在IL-12協(xié)同下激活NK細(xì)胞，殺傷活性增強(qiáng)，并分泌IFN-r，IFN-r反過來進(jìn)一步促進(jìn)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞的激活。 協(xié)同刺激抗原特異性B細(xì)胞和T細(xì)胞分化，在Thl細(xì)胞因子的作用下，顯著增強(qiáng)獲得性細(xì)胞免疫優(yōu)良的T細(xì)胞免疫佐劑。,霍亂毒素（CT） 大腸桿菌不耐熱毒素（LT） 破傷風(fēng)類毒素（TT）,3、基因工程減毒素,良好的粘膜免疫佐劑 由A

37、和B兩個(gè)區(qū)構(gòu)成的蛋白； B區(qū)具有主要免疫學(xué)作用，內(nèi)含5種獨(dú)立的非共價(jià)連接的B亞單 位（CTB），無毒性，可與細(xì)胞結(jié)合； A區(qū)是CT的生物學(xué)活性部分，具有酶活性。,霍亂毒素（CT）,仙臺(tái)病毒—CT；CTB—流感病毒HA；鏈球菌表面蛋白—CTB； CT毒素A和B兩個(gè)亞單位的表達(dá)質(zhì)粒DNA作為佐劑與DNA疫苗聯(lián)和應(yīng)用，還可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生很強(qiáng)的Th1細(xì)胞因子反應(yīng)（如IFN-γ）和Th2細(xì)胞因子反應(yīng)（如IL-4），具有很強(qiáng)的佐劑作用。

38、,大腸桿菌LT毒素有A和B兩個(gè)亞單位，有一定抗原性A亞單位基因工程點(diǎn)突變體LT (R192G) ——無毒性作用，但仍保留了其佐劑效應(yīng) ——可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生局部粘膜免疫反應(yīng)。,大腸桿菌不耐熱毒素（LT）,利用基因突變技術(shù)，構(gòu)建的A和B兩個(gè)亞單位的表達(dá)質(zhì)粒DNA聯(lián)合應(yīng)用，也可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生很強(qiáng)的Th1細(xì)胞因子反應(yīng)（IFN-γ）和Th2細(xì)胞因子反應(yīng)（IL-4）。而且，LT毒素表達(dá)質(zhì)粒作為佐劑，可協(xié)助DNA疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生

39、更強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，有望成為一種新型免疫增強(qiáng)劑。,ISCOM由抗原物質(zhì)與由皂樹皮提取的一種糖苷Quil A和膽固醇按1:1:1混合后自發(fā)形成的一種具有較高免疫活性的脂質(zhì)小泡。 ISCOM直徑40nm，每個(gè)ISCOM約含10～12分子的蛋白質(zhì)。 ISCOM應(yīng)用于多種細(xì)菌、病毒和寄生蟲病的疫苗，具有產(chǎn)生“全面”免疫應(yīng)答的效力，可長期增強(qiáng)特異性抗體應(yīng)答。 ISCOM能有效地通過粘膜給藥，從而可以用于抗呼吸道感染。 目前，獸用IS