嗜酸乳酸桿菌S-層蛋白拮抗腸道病原菌粘附或入侵宿主細(xì)胞機(jī)制的研究.pdf

1、S-層蛋白( S-layer protein)是乳酸桿菌表面的一層蛋白分子，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)該蛋白對(duì)腸道病原菌具有拮抗作用。腸道病原菌主要是通過(guò)粘附或入侵、誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重排和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、影響細(xì)胞凋亡達(dá)到入侵宿主上皮細(xì)胞的目的．拮抗和阻止病原茵的粘附及入侵作用是保護(hù)細(xì)胞免受感染的有效方法。本研究旨在探討乳酸桿菌S-層蛋白拮抗腸道病原菌的作用機(jī)制。首先提取和純化嗜酸乳酸桿菌的S-層蛋白，研究S-層蛋白對(duì)腸道病原菌的拮抗作用；然后應(yīng)用人結(jié)腸腺癌細(xì)

2、胞系（Caco-2細(xì)胞）作為體外模型，檢測(cè)S-層蛋白拮抗鼠傷寒沙門(mén)氏菌粘附及入侵Caco-2細(xì)胞的影響，包括細(xì)菌的粘附入侵、細(xì)胞骨架的變化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和細(xì)胞凋亡中幾種因子的變化等，以期揭示乳酸桿菌S-層蛋白拮抗腸道病原菌粘附或入侵宿主細(xì)胞機(jī)制．主要分為以下五個(gè)試驗(yàn)：試驗(yàn)一：嗜酸乳酸桿菌S-層蛋白的提取純化
　　 本試驗(yàn)應(yīng)用已知具有S-層蛋白的嗜酸乳酸桿菌ATCC4356作為對(duì)照，從蛋白和基因兩個(gè)水平對(duì)36株豬十二腸分離得到的乳

3、酸桿菌進(jìn)行S-層蛋白菌株篩選，然后提取純化S-層蛋白并制備抗血清。結(jié)果顯示：36株乳酸桿菌均不存在S-層蛋白．本試驗(yàn)提取純化得到嗜酸乳酸桿菌的S-層蛋白，應(yīng)用該S-層蛋白接種新西蘭兔，制備得到S-層蛋白抗血清，瓊擴(kuò)效價(jià)為1：16。本試驗(yàn)表明乳酸桿菌S-層蛋白只存在于某些菌株中。試驗(yàn)二：嗜酸乳酸桿菌S-層蛋白對(duì)腸道病原菌粘附或入侵的拮抗作用
　　 首先應(yīng)用三種不同的粘附試驗(yàn)：競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)( competition assay)、排斥試

4、驗(yàn)(exclusionassay)和置換試驗(yàn)(displacement assay)，分別研究S-層蛋白對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88和鼠傷寒沙門(mén)氏菌SL1344粘附或入侵Caco-2細(xì)胞的拮抗作用，然后應(yīng)用Dot-blot方法檢測(cè)S-層蛋白與兩種細(xì)菌及Caco-2細(xì)胞的結(jié)合。結(jié)果顯示：S-層蛋白能夠顯著協(xié)同產(chǎn)腸毒素大腸桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的粘附．排斥試驗(yàn)和競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)的相對(duì)粘附力分別為452.30％±2.26%（P<0.01）和155.57%

5、±5.81%(P<0.05)．S-層蠶白在排斥試驗(yàn)中，對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的協(xié)同粘附高于競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)。嗜酸乳酸桿菌也表現(xiàn)出明顯的協(xié)同產(chǎn)腸毒素大腸桿菌粘附的效應(yīng)．相反，S-層蛋白則能顯著地拮抗鼠傷寒沙門(mén)氏菌的粘附及入侵。在競(jìng)爭(zhēng)、排斥、置換三種粘附試驗(yàn)中，S-層蛋白可顯著降低鼠傷寒沙門(mén)氏菌的粘附，其相對(duì)粘附力分別為1.17%±5.97%、8.71%±1.36%，10.56%±0.92%，差異極顯著（P<0.01），其中競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)效果最好；并且S-層

6、蛋白對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌粘附拮抗作用極顯著高于嗜酸乳酸桿菌(P<0.01)；此外，S-層蛋白也能顯著拮抗鼠傷寒沙門(mén)氏菌入侵。Dot-blot顯示，S-層蛋白均可在兩種細(xì)菌和Caco-2細(xì)胞表面自我組裝。本試驗(yàn)表明，S-層蛋白協(xié)同增加產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的粘附；卻可顯著拮抗鼠傷寒沙門(mén)氏菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的粘附及入侵。S-層蛋白可能通過(guò)與鼠傷寒沙門(mén)氏菌競(jìng)爭(zhēng)粘附受體，修飾細(xì)菌或Caco-2細(xì)胞表面相關(guān)結(jié)構(gòu)介導(dǎo)拮抗作用．試驗(yàn)三：嗜

7、酸乳酸桿菌S-層蛋白拮抗鼠傷寒沙門(mén)氏菌對(duì)細(xì)胞骨架的研究
　　 鼠傷寒沙門(mén)氏菌粘附或入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中可顯著引起細(xì)胞骨架變化。在試驗(yàn)二的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)首先研究S-層蛋白對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌SL1344感染Caco-2細(xì)胞微線毛和上皮完整性的變化；然后研究S-層蛋白抗感染過(guò)程中對(duì)Caco-2細(xì)胞微絲分布及其微絲相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白R(shí)acl表達(dá)的影響．結(jié)果顯示：鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染Caeo-2細(xì)胞后，可引起上皮細(xì)胞微絨毛變短，細(xì)胞微絲排列紊亂，細(xì)胞

8、跨膜電阻下降。嗜酸乳酸桿菌S-層蛋白則能夠拮抗鼠傷寒沙門(mén)氏菌對(duì)細(xì)胞微絲骨架的改變，并可減少鼠傷寒沙門(mén)氏菌引起Caco-2細(xì)胞跨膜電阻的破壞。鼠傷寒沙門(mén)氏菌可使Caco-2細(xì)胞Racl蛋白的表達(dá)量顯著升高（0.39-0.02 VS0.15-0.01；P<0.001），而S-層蛋白則可極顯著上調(diào)感染鼠傷寒沙門(mén)氏菌后Caco-2細(xì)胞Rael蛋白的表達(dá)(0.58+0.01 VS0.39-0.02;P<0.01)．本試驗(yàn)表明嗜酸乳酸桿菌S-層蛋白

9、可能通過(guò)拮抗鼠傷寒沙門(mén)氏菌對(duì)細(xì)胞微絨毛和微絲骨架的破壞；上調(diào)Rae1蛋白表達(dá)來(lái)拮抗鼠傷寒沙門(mén)氏茵的粘附及入侵。試驗(yàn)四：嗜酸乳酸桿菌S-層蛋白拮抗鼠傷寒沙門(mén)氏菌對(duì)細(xì)胞MAPK信號(hào)通路的研究
　　 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）信號(hào)通路對(duì)病原菌的防御發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)研究了S-層蛋白拮抗鼠傷寒沙門(mén)氏菌SL1344過(guò)程中對(duì)Caco-2細(xì)胞MAPK信號(hào)通路三種重要亞族E

10、RK、JNK和p38的影響。結(jié)果顯示：鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染Caco-2細(xì)胞后，ERKl/2(0.34±0.02 VS0.04±0.01；P<0.001)、JNK(1.77±0.19 VS0.88±0.10; P<0.01)和p38(0.93±0.07 VS0.72±0.02;P<0.05)的磷酸化水平均顯著升高。S-層蛋白可明顯增加Caco-2細(xì)胞ERKl/2的磷酸化(0.54±0.04;P<0.001)，而不影響JNK與p38的活化。當(dāng)

11、S-層蛋白與鼠傷寒沙門(mén)氏菌共孵育后，細(xì)胞ERK1/2磷酸化水平(0.12±0.01)極顯著低于分別單獨(dú)作用細(xì)胞后的水平(P<0.001)，并且S-層蛋白可以顯著拮抗鼠傷寒沙門(mén)氏菌對(duì)Caeo-2細(xì)胞JNK(0.64±0.05 VS1.77±0.19;P<0.01)和p38(0.61±0.04 VS0.93±0.07;P<0.05)的磷酸化。本研究表明S-層蛋白可能阻斷細(xì)菌對(duì)MAPK信號(hào)通路的活化發(fā)揮拮抗鼠傷寒沙門(mén)氏菌的作用。試驗(yàn)五：嗜酸乳

12、酸桿菌S-層蛋白拮抗鼠傷寒沙門(mén)氏菌對(duì)細(xì)胞凋亡的研究
　　 病原菌可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡，主要表現(xiàn)為推遲凋亡時(shí)間，引起凋亡損傷，本試驗(yàn)首先研究鼠傷寒沙門(mén)氏菌引起Caco-2細(xì)胞凋亡的途徑；然后研究嗜酸乳酸桿菌S-層蛋白拮抗鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染引起細(xì)胞凋亡的機(jī)理。結(jié)果顯示：鼠傷寒沙門(mén)氏菌顯著誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞的凋亡造成損傷。鼠傷寒沙門(mén)氏菌誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞凋亡并不激活Caspase-1，而是顯著誘導(dǎo)Caspase-3的活化。S．層蛋白