水稻花粉半不育基因PSS1的圖位克隆與功能研究.pdf

1、突變體是研究基因表達(dá)與功能分析的良好試驗(yàn)材料，也是當(dāng)前功能基因組學(xué)研究的研究熱點(diǎn)之一。雄性不育突變體在植物的育種、遺傳學(xué)、生殖生物學(xué)和分子生物學(xué)的研究中提供了很好的材料。為了更好地理解花粉發(fā)育的分子機(jī)制，有必要識(shí)別和分離涉及此過程各個(gè)階段的基因，并對其進(jìn)行功能分析。
　　 有關(guān)水稻半不育的報(bào)道多以秈粳雜種半不育為主，并提出了很多假說，但半不育的分子機(jī)制仍不清楚。究其原因，秈粳雜種半不育多是由秈粳間不親和基因位點(diǎn)互作引起的，遺傳基

2、礎(chǔ)較為復(fù)雜，不同的組合可能具有不同的不育位點(diǎn)，同時(shí)也往往受遺傳背景的影響，研究起來較為困難，若能用穩(wěn)定的半不育材料進(jìn)行研究，闡明半不育產(chǎn)生的分子機(jī)制，對克服生產(chǎn)中遇到的半不育問題具有重要的借鑒意義。為此，本研究對穩(wěn)定的半不育突變體材料w207-2進(jìn)行了詳細(xì)的細(xì)胞學(xué)分析并運(yùn)用圖位克隆的方法分離了花粉半不育基因，該結(jié)果為從分子水平上揭示水稻及其它禾本科作物半不育性的分子生物學(xué)基礎(chǔ)具有重要的指導(dǎo)意義。
　　 本論文主要研究結(jié)論如下:<

3、br>　　 1.通過對水稻半不育突變體w207-2的形態(tài)和細(xì)胞學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)突變體的主要特征是:營養(yǎng)生長和花器官發(fā)育基本正常，自交結(jié)實(shí)率穩(wěn)定在30％-40％之間，花粉育性穩(wěn)定在50％左右，而雌配子育性正常。掃描和透射電鏡觀察表明，突變體中不育的花粉瘦癟，且極度變形，花粉內(nèi)含物空缺，無淀粉粒積累，花粉肉壁缺失，外壁結(jié)構(gòu)異常，覆蓋層和基足層肥厚，基粒棒趨于解體。通過花粉粒計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)突變體每花藥的花粉?？倲?shù)相當(dāng)于野生型的78％，可育花粉總數(shù)相

4、當(dāng)于野生型的40％。另外，還觀察到突變體花藥開裂性差，造成開花時(shí)花粉散出量減少，使散落在柱頭上的花粉?？倲?shù)減少，繼而導(dǎo)致小穗育性降低，因此除了花粉半不育外，裂藥性差也是造成結(jié)實(shí)率低的原因之一。
　　 2.花藥發(fā)育過程的半薄組織切片分析表明，突變體的花藥壁發(fā)育正常，絨氈層和中層能夠正常解體。細(xì)胞學(xué)觀察表明:突變體在減數(shù)分裂中期Ⅰ有一定數(shù)量的單價(jià)體，在后期Ⅱ能觀察到落后染色體和染色體橋，在后期Ⅲ也能觀察到落后染色體，在四分體時(shí)期有微

5、核形成。以上結(jié)果表明，突變的基因與減數(shù)分裂有關(guān)，因此本研究中的材料是一個(gè)研究水稻減數(shù)分裂分子機(jī)制的優(yōu)良材料。
　　 3.選擇花粉育性作為育性指標(biāo)，用9600株w207-2/Dular F2分離群體中2100株純合隱性半不育個(gè)體將該半不育基因pss1精細(xì)定位于CAPS標(biāo)記L2和dCAPS標(biāo)記L3之間，距兩標(biāo)記均為0.02cM。兩標(biāo)記位物理距離約為28kb，含有5個(gè)完整的開放閱讀框。與野生型相比，突變體在KINESIN1-LIKE基

6、因的編碼區(qū)存在一個(gè)單堿基突變，引起了一個(gè)保守氨基酸的改變。確定該基因?yàn)閜ss1的候選基因，并進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因功能互補(bǔ)驗(yàn)證。
　　 4.利用RACE結(jié)合RT-PCR技術(shù)獲得了OsKINESIN-1基因的全長cDNA，利用RT-PCR分析結(jié)合OsKINESIN1 promoter::GUS的轉(zhuǎn)基因水稻的染色觀察結(jié)果顯示，該基因在各個(gè)組織均有表達(dá)，但在穗中表達(dá)量較高，并且在幼穗的發(fā)育過程中有一個(gè)上調(diào)表達(dá)然后又降低表達(dá)的過程，其表達(dá)量的最高