水稻卷葉基因PL14和葉綠體發(fā)育基因TLC1的圖位克隆與功能分析.pdf

1、1.RL14基因的圖位克隆與功能分析
　　 葉片是植物接受和轉(zhuǎn)化太陽(yáng)能的主要器官。水稻等高密度栽培的農(nóng)作物，適度卷葉對(duì)改善中下部葉片受光條件、延緩葉片衰老、延長(zhǎng)葉片功能期，從而提高產(chǎn)量具有一定的作用。袁隆平等育種家也提出，葉片適度卷曲是水稻理想株型要素之一。在長(zhǎng)期的育種實(shí)踐和基礎(chǔ)研究過(guò)程中，也積累一部分性狀優(yōu)良的卷葉材料和突變體，但是對(duì)其卷葉形成的生理和分子遺傳機(jī)理的研究還相對(duì)滯后。本研究在EMS(甲基磺酸乙酯)誘變縉恢10號(hào)，

2、所得突變體庫(kù)中篩選獲得2個(gè)卷葉等位突變體，命名為rolling leaf14-1(rl14-1)，rolling leaf14-2(rl14-2)。因其卷葉形態(tài)相似，所以本研究以縉恢10號(hào)為野生型對(duì)照，對(duì)突變體rl14-1農(nóng)藝性狀、株型特征進(jìn)行了分析。利用掃描電鏡、組織切片等儀器和技術(shù)，對(duì)rl14-1突變體進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)特征研究。以分子標(biāo)記為基礎(chǔ)完成了RL14基因的圖位克隆，并結(jié)合qRTPCR技術(shù)、mRNA組織原位雜交技術(shù)對(duì)RL1

3、4基因的時(shí)空表達(dá)特征進(jìn)行了分析。
　　 主要結(jié)果如下：
　　 1.1 rl14突變體特征
　　 rl14-1突變體全生育期表現(xiàn)葉片卷曲性狀。抽穗期功能葉卷曲度介于40％-50％之間，突變體功能葉葉基角顯著小于野生型對(duì)照，表現(xiàn)葉片卷曲、挺直。突變體株高低于野生型，而千粒重顯著高于野生型對(duì)照。突變體葉片蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度均顯著低于野生型對(duì)照，而水分利用效率顯著高于野生型對(duì)照。突變體葉片氣孔復(fù)合體面積顯著低于野生型。對(duì)

4、不同時(shí)期突變體葉片石蠟切片分析表明，突變體葉片泡狀細(xì)胞形態(tài)異常呈萎縮失水狀。
　　 1.2圖位克隆
　　 rl14突變體突變性狀受隱性單基因控制，初步定位將RL14定位在第10染色體SSR標(biāo)記RM3123和RM1162之間遺傳距離分別為7.5cM和9.6cM。精細(xì)定位將RL14定位在標(biāo)記SID2與SW24之間，物理距離24.5kb區(qū)域內(nèi)。對(duì)定位區(qū)間內(nèi)的注釋基因測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，突變體rl14-1為啟動(dòng)子序列突變，突變導(dǎo)致基因

5、表達(dá)量顯著下降。突變體rl14-2為基因編碼序列突變，突變導(dǎo)致RL14蛋白保守區(qū)域氨基酸序列發(fā)生異亮氨酸(I)到蘇氨酸(T)的替換。轉(zhuǎn)基因功能互補(bǔ)驗(yàn)證試驗(yàn)表明轉(zhuǎn)基因植株葉片平展，泡狀細(xì)胞形態(tài)正常。蛋白質(zhì)序列分析發(fā)現(xiàn)RL14基因編碼20G-Fe(Ⅱ)氧化酶蛋白，屬20G-Fe(Ⅱ)氧化酶基因家族。RL14蛋白在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中均有分布。組織特異性分析表明RL14基因在根、全展葉、葉鞘中表達(dá)量較高，在未抽葉、莖及幼穗中微量表達(dá)。mRNA組織

6、原位雜交分析表明在尚未抽出的幼葉中RL14基因僅在維管束兩側(cè)厚壁細(xì)胞中表達(dá)，而在全展葉片中RL14基因的表達(dá)擴(kuò)展到整個(gè)葉肉細(xì)胞中，表達(dá)時(shí)期與細(xì)胞次生壁的形成時(shí)期相符。
　　 1.3相關(guān)基因表達(dá)分析及纖維素木質(zhì)素含量測(cè)定
　　 細(xì)胞次生壁形成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、纖維素和木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因表達(dá)量在rl14-1葉片中均顯著變化；突變體葉片纖維素含量顯著上升，木質(zhì)素含量顯著下降，進(jìn)一步證明RL14基因影響厚壁細(xì)胞及葉肉細(xì)胞次生壁的形成

7、。結(jié)合rl14-1突變體所表現(xiàn)的生理和細(xì)胞學(xué)特征，我們推測(cè)細(xì)胞次生壁組成和結(jié)構(gòu)的變化影響從葉片維管束到泡狀細(xì)胞的水分運(yùn)輸導(dǎo)致葉片卷曲。
　　 2溫敏性黃綠葉突變體tlc1的基因克隆和功能分析
　　 葉綠體是植物特有的、稱(chēng)為質(zhì)體的細(xì)胞器家族中的一員。葉綠體也像線(xiàn)粒體，有自己的DNA、RNA和核糖體，表現(xiàn)出相當(dāng)程度的自主性。但是許多關(guān)鍵的葉綠體組分蛋白仍由細(xì)胞核基因編碼，所以葉綠體的發(fā)育和功能發(fā)揮，需要核基因和葉綠體編碼基因

8、相協(xié)調(diào)。葉色突變常直接或間接與葉綠體發(fā)育相關(guān)，因此是研究葉綠體發(fā)育的重要材料。本研究所在水稻EMS突變體庫(kù)中，發(fā)現(xiàn)一個(gè)溫度敏感型黃葉突變體，命名為temperature-impressible leaf color1(tlc1)。在不同栽培條件下，對(duì)其表型特征進(jìn)行了跟蹤觀察，對(duì)突變體光合色素含量，葉綠體特征等進(jìn)行了觀測(cè)分析。同時(shí)對(duì)突變基因進(jìn)行了遺傳分析和圖位克隆。主要結(jié)果如下：
　　 2.1突變體tlc1表型及生理特征
　

9、　 大田栽培條件下tlc1突變體葉色表現(xiàn)為黃、綠相間。20℃、30℃恒溫條件下，突變體葉片分別表現(xiàn)為黃色和淡綠色。20℃突變體葉綠素含量急劇下降，H2O2大量累積，葉綠體分化受阻，呈質(zhì)體狀態(tài)。PSⅡ(光系統(tǒng)Ⅱ)各項(xiàng)參數(shù)，類(lèi)囊體膜蛋白含量均顯著下降。
　　 2.2基因精細(xì)定位及候選基因分析
　　 精細(xì)定位將TLC1基因定位于第3染色體SSR標(biāo)記RM15330與Y10之間，物理距離68.4Kb范圍內(nèi)，與SSR標(biāo)記Y7共分離

10、。對(duì)定位區(qū)間內(nèi)所包含的13個(gè)編碼基因測(cè)序分析，未在突變體與野生型間發(fā)現(xiàn)編碼序列差異。對(duì)13個(gè)基因在不同溫度下表達(dá)量進(jìn)行qRTPCR分析，發(fā)現(xiàn)突變體中TLC1基因的表達(dá)量在低溫下顯著低于野生型。結(jié)合TLC1基因表達(dá)模式和突變體葉綠體發(fā)育特征將候選基因確定為T(mén)LC1。
　　 2.3葉綠體發(fā)育、葉綠素合成、PSⅠ、PSⅡ相關(guān)基因表達(dá)分析
　　 對(duì)不同栽培條件下葉綠體發(fā)育、葉綠素合成、PSⅠ、PSⅡ相關(guān)基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，TLC1