水稻824ys黃綠葉突變基因的圖位克隆及功能分析.pdf

1、葉綠素(Chl)是光合色素的主要成分，它廣泛存在于光合生物體中，在天線系統(tǒng)中捕獲光能，并驅(qū)動(dòng)電子轉(zhuǎn)移到反應(yīng)中心。在高等植物中有Chla和Chlb二種葉綠素，光合反應(yīng)中心僅含Chla，外圍光捕獲天線復(fù)合物則含有Chla和Chlb。葉綠素生物合成從谷氨酰-tRNA到Chla，再到Chlb，整個(gè)生物合成過(guò)程需要15步反應(yīng)。目前，在以擬南芥(Arabidopsisthaliana)為代表的被子植物中，控制葉綠素生物合成所有15步反應(yīng)的酶基因都已

2、成功克隆。擬南芥全基因組分析表明，其葉綠素生物合成從谷氨酰-tRNA到Chlb需要15種酶，編碼這些酶的基因有27個(gè)。然而，水稻(Oryzasativa)中迄今只克隆了編碼參與葉綠素生物合成的3個(gè)酶的6個(gè)基因，它們是編碼Mg-螯合酶三個(gè)亞基的OsChlH、OsChlD和OsChlI基因，編碼葉綠素合酶的YGLl基因，以及編碼葉綠素酸酯a加氧酶的OsCAO1和OsCAO2基因。
　　 有氧光合生物的葉綠素，根據(jù)乙烯側(cè)鏈的數(shù)目，可以

3、分為3，8-聯(lián)乙烯葉綠素(DV-Chl)和3-乙烯葉綠素即單乙烯葉綠素(MV-Chl)二類。幾乎所有的有氧光合生物，盡管他們固有的生存環(huán)境不同，但在正常生長(zhǎng)情況下都只含有MV-Chl。3，8-聯(lián)乙烯（原）葉綠素(酸酯)a8-乙烯還原酶(DVR)將四吡咯上的8-乙烯基還原為乙基，這對(duì)于MV-Chl的生物合成是必不可少的。迄今，己分別從擬南芥、綠硫細(xì)菌(Chlorobiumtepidum)和胞藻(Synechocystissp.PCC680

4、3)中克隆了3個(gè)聯(lián)乙烯還原酶基因(DVR，bciA和slr1923)，酶學(xué)分析證實(shí)重組DVR和BciA蛋白分別能催化聯(lián)乙烯葉綠素酸酯(DV-Chlide)a和聯(lián)乙烯原葉綠素酸酯(DV-Pchlide)a轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的MV-型物質(zhì)。然而，單子葉植物中還沒有克隆該酶基因的報(bào)導(dǎo)。
　　 本研究從秈稻824B中分離出的一個(gè)自然黃化突變體824ys，該突變體在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期表現(xiàn)黃綠葉，植株生長(zhǎng)非常緩慢，盡管它的抽穗期比野生型親本延遲16天，

5、但株高和有效分蘗數(shù)分別減少25.6％和64.9％。葉片色素含量測(cè)定結(jié)果顯示，824ys突變體的Chla、Chlb和總?cè)~綠素含量分別只有野生型親本的41～48％、9～22％和33～42％，表明該突變體表型是由葉綠素含量降低引起的。運(yùn)用透射電子顯微鏡觀察葉綠體形態(tài)和發(fā)育，結(jié)果顯示，與野生型親本相比較，824ys突變體葉肉細(xì)胞和葉綠體的形狀均不規(guī)則，葉綠體數(shù)目減少，葉綠體的類囊體膜發(fā)生退化，排列較混亂，基粒垛疊較少，表明該突變體中葉綠體的發(fā)育

6、受到抑制。
　　 遺傳分析表明824ys黃綠葉突變性狀由1對(duì)隱性核基因控制，該突變基因初步定位在水稻第3染色體短臂，與SSR標(biāo)記RM282相距5.2cM。運(yùn)用824ys突變體與粳稻品種02428雜交F2代作為定位群體，進(jìn)一步將824ys突變位點(diǎn)定位于2個(gè)InDel標(biāo)記PR809和PR826之間，遺傳距離分別為0.2cM和0.4cM，這2個(gè)標(biāo)記將突變基因界定在一個(gè)142kb長(zhǎng)的區(qū)域內(nèi)。在該區(qū)域發(fā)現(xiàn)一個(gè)開放閱讀框(ORF)Os03g

7、22780編碼假定的異黃酮還原酶，序列BLASTX比對(duì)顯示它的蛋白質(zhì)產(chǎn)物與擬南芥聯(lián)乙烯還原酶(DVR)有65％的同源性。于是，分別從野生型和824ys突變體中克隆了這個(gè)Os03g22780基因，DNA測(cè)序結(jié)果顯示824ys突變體中該ORF在第952～960位缺失9個(gè)核苷酸，從而導(dǎo)致其蛋白質(zhì)產(chǎn)物缺失3個(gè)氨基酸(Lys、Val和Pro)。因此，認(rèn)為Os03g22780基因是824ys突變位點(diǎn)的候選基因，暫命名為OsDVR基因。水稻基因組數(shù)據(jù)

8、庫(kù)BLAST搜索結(jié)果顯示OsDVR是一個(gè)單拷貝基因，ORF長(zhǎng)1218bp，編碼一個(gè)含405氨基酸的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)分子量約43kD。OsDVR蛋白質(zhì)在其N-端含有一個(gè)由58個(gè)氨基酸組成的明顯的葉綠體靶序列。
　　 利用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)了824ys突變體的葉綠素組成成分，結(jié)果顯示該突變體所含葉綠素是DV-Chl，它沒有MV-Chl，表明該突變體含有一個(gè)有缺陷的聯(lián)乙烯還原酶(DVR)，因此，我們確信824ys突變位點(diǎn)的候

9、選基因就是OsDVR。為了檢測(cè)OsDVR重組蛋白能否表現(xiàn)出DVR酶活性，在大腸桿菌中表達(dá)野生型OsDVR和突變型Osdvr重組蛋白，用NADPH作為還原劑，4種四吡咯物質(zhì)(DV-Chla、-Chlb、-Chlidea和-Chlideb)作為反應(yīng)底物。結(jié)果表明該重組蛋白不僅能將DV-Chlidea轉(zhuǎn)化為MV-Chlidea，而且能將DV-Chla轉(zhuǎn)化為MV-Chla，因此，證實(shí)了OsDVR(Os03g22780)編碼有功能的水稻聯(lián)乙烯還原