水稻籽粒中控制淀粉合成關鍵基因OsPDILl-1的圖位克隆及功能分析.pdf

1、谷類作物種子內淀粉的積累對于作物產量的形成具有極為重要的意義。種子淀粉的生物合成是各種酶催化的過程，這一模型已經初步建立。然而隨著越來越多的該模型外的粉質突變體基因的發(fā)現，新的多網絡交叉模型的建立顯得尤為重要。為尋找淀粉合成相關的新基因，我們對實驗室已有的日本晴T-DNA插入突變體庫和日本晴、93-11輻射誘變突變體庫進行了篩選（總共篩選11400份變突變體材料），并鑒定到多份粉質突變體。本文針對其中的一個突變體——T3612，進行詳細

2、研究，并取得如下研究進展:
　　T3612種子外觀及橫截面呈現不透明粉質表型，與野生型日本晴相比較千粒重下降33.7％;突變體種子橫截面掃描電鏡觀察結果顯示，T3612淀粉顆粒變圓、變小，而且排列疏松;突變體種子生理生化測定結果顯示，蛋白質和脂肪含量上升大約15％，直鏈淀粉含量是野生型的80％。
　　通過圖位克隆的方法，利用T3612/南京11F2群體中1242個粉質表型極端個體，將目的基因定位于第11染色體短臂25cM處，

3、位于OSJNBa0058P12BAC克隆的T3612-54和T3612-31兩個標記間的61kb區(qū)域。經RICEGAAS預測該區(qū)間有11個基因，RT-PCR表明該區(qū)間PDIL1-1未表達。基因組序列測序表明PDIL1-1從ATG后124bp處開始總共缺失4145bp。功能互補實驗進一步證實了我們所克隆到的基因PDIL1-1就是控制突變性狀的關鍵基因。
　　利用半定量RT-PCR和westernblot進行組織表達模式分析，結果表明

4、PDIL1-1呈現組成性表達，在根、莖、葉、鞘、穗和胚乳中均有表達，而且在發(fā)育12天的胚乳中表達量最高。但是在突變體T3612中，不論是在RNA水平還是蛋白水平均檢測不到PDIL1-1的表達。這進一步確證粉質突變體T3612確實是PDIL1-1缺失型突變體。
　　我們利用熒光定量RT-PCR的方法，檢測了31個淀粉合成相關基因的表達情況。與野生型比較，突變體中OsAGPL2、OsPHOL、OsSuSy2和OsSuSy3的表達增加了

5、將近1倍;另外OsAGPL1、OsAGPL4、OsSSIIb，OsPHOH和OsDPE-1的表達降低至野生型的一半。利用非變性淀粉膠電泳后活性染色的方法，我們檢測了突變體發(fā)育9天和12天胚乳中淀粉合成酶（starchsynthase，SS）、淀粉分支酶（branchingenzyme，BE）、淀粉磷酸化酶(StarchPhosphorylase，Pho)和淀粉脫分支酶(debranchingenzyme，DBE)的活性?；钚匀旧Y果顯示

6、，普魯蘭酶的活性下降，而且突變體普魯蘭酶條帶遷移率下降，ISA的活性沒有明顯差異;SSI的活性顯著上升，而SSIII的活性變化不明顯;Phol的活性顯著下降，Pho2的活性沒有變化;淀粉分支酶的活性均未變化。另外ADPG焦磷酸化酶(AGPase)和蔗糖合酶(SucroseSynthase)的活性顯著增加，UDPG焦磷酸化酶(UGPase)活性變化不大。除此之外，我們利用基于DNA測序的熒光糖電泳(DSA-FACE)的方法測定了突變體種子

7、中支鏈淀粉鏈長分布特征。結果8≤DP≤13的鏈長比例增加，6≤DP≤7的鏈長比例降低。
　　PDIL1-1編碼一個蛋白質二硫鍵異構酶。體外表達PDIL1-1重組蛋白并進行酶活實驗分析，表明我們克隆到的重組PDIL1-1蛋白可以還原胰島素，而且還原活性與PDIL1-1蛋白的濃度成正比。另外，重組PDIL1-1在體外可以有效地抑制檸檬酸合酶的熱變性，說明其具有分子伴侶活性。
　　PDIL1-1通過對底物蛋白二硫鍵的氧化還原，可以

8、幫助其形成正確構象。熒光定量RT-PCR檢測分析發(fā)現突變體胚乳細胞中Bip、Hsp70、Hsp90、CRT、CNX等分子伴侶基因，NEF、ERdj3like、Stt3a和UDPG-glucose-transporteor等輔助分子伴侶基因，bZIP轉錄因子基因bZIP60和ERAD降解途徑基因Derlins的表達量均高于野生型。這些基因受內質網脅迫（ERstress）所誘導表達，這說明突變體胚乳細胞內發(fā)生內質網脅迫。內質網脅迫可使細胞啟