水稻長(zhǎng)葉毛基因Hairy Leaf6的圖位克隆與功能分析.pdf

1、表皮毛是一種由植物表皮細(xì)胞特化形成的組織，廣泛分布于各種植物的表面。表皮毛可以在植物表皮形成一層物理屏障，幫助植物抵御病蟲(chóng)的侵害、疏散葉片表面的熱量、減少紫外線(xiàn)的輻射傷害以及降低水分的蒸騰速率，對(duì)植物抵御各種逆境和脅迫具有積極的作用。表皮毛作為一種細(xì)胞的特殊形態(tài)，是研究細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和分化等生物學(xué)過(guò)程的經(jīng)典模式，在擬南芥中進(jìn)行了廣泛的研究;水稻作為單子葉模式植物，以往的研究多集中于株型、產(chǎn)量、品質(zhì)以及抗性等方面，對(duì)表皮毛的研究較少。為了解

2、析調(diào)控水稻表皮毛生長(zhǎng)發(fā)育的遺傳基礎(chǔ)和分子機(jī)制，本研究利用關(guān)聯(lián)分析和連鎖分析的方法研究了調(diào)控水稻葉片表皮毛性狀的遺傳基礎(chǔ)，圖位克隆了控制長(zhǎng)毛葉表型的關(guān)鍵基因HL6，并研究了其功能，提出了水稻表皮毛發(fā)育的分子調(diào)控模型，得到的主要結(jié)果如下:
　　1.對(duì)253份核心種質(zhì)的葉毛表型進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)水稻種質(zhì)中存在3種葉毛表型:光滑、短毛和長(zhǎng)毛。利用50K的SNP芯片基因型進(jìn)行葉毛性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析，在第6染色體上檢測(cè)到2個(gè)與長(zhǎng)毛表型顯著關(guān)聯(lián)的

3、位點(diǎn)，對(duì)2個(gè)候選基因Loc_Os06g44300和Loc_Os06g44320進(jìn)行超量表達(dá)，結(jié)果顯示這2個(gè)基因的轉(zhuǎn)基因植株的表皮毛都沒(méi)有明顯的變化，表明可能由其他的基因調(diào)控水稻種質(zhì)中葉毛表型的變異。
　　2.對(duì)長(zhǎng)毛品系W39與短毛品種ZS97構(gòu)建的F2群體分析發(fā)現(xiàn)葉片長(zhǎng)毛表型由單位點(diǎn)顯性基因控制;利用BSA方法將控制長(zhǎng)毛表型的基因初步定位到第6染色體上，命名為Hairy Leaf6(HL6)，進(jìn)一步將HL6精細(xì)定位到S5至S9的5

4、5kb區(qū)間內(nèi)，互補(bǔ)轉(zhuǎn)化的結(jié)果表明Loc_Os06g44750就是HL6基因。序列比對(duì)顯示雙親間HL6的啟動(dòng)子和編碼區(qū)都存在變異，導(dǎo)致HL6的表達(dá)水平和氨基酸序列都存在差異。通過(guò)互補(bǔ)載體的啟動(dòng)子替換以及不同HL6等位基因的超表達(dá)轉(zhuǎn)化發(fā)現(xiàn)由啟動(dòng)子調(diào)控的HL6的轉(zhuǎn)錄水平對(duì)調(diào)控表皮毛的伸長(zhǎng)具有主要作用，而蛋白結(jié)構(gòu)的變化對(duì)表皮毛的伸長(zhǎng)沒(méi)有明顯的影響。
　　3.HL6編碼含有1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，定位于細(xì)胞核，通過(guò)C端發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活的功能

5、。同源分析顯示HL6與擬南芥控制子葉異位表皮毛形成的EMBRYOMAKER蛋白關(guān)系最近，表明AP2蛋白在調(diào)控單子葉和雙子葉植物表皮毛發(fā)育的過(guò)程中可能具有保守的功能。
　　4.激素處理發(fā)現(xiàn)HL6ZS97的表達(dá)受生長(zhǎng)素的輕微抑制，而HL6W39受到大約2倍的誘導(dǎo);分析發(fā)現(xiàn)位于HL6啟動(dòng)子-2375位的A/C SNP和-2361位的19bpINDEL會(huì)造成HL6ZS97啟動(dòng)子中的2個(gè)生長(zhǎng)素反應(yīng)元件發(fā)生突變，導(dǎo)致OsARF25不能與這2個(gè)

6、生長(zhǎng)素反應(yīng)元件互作，引起了HL6W39和HL6ZS97對(duì)生長(zhǎng)素的不同反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致了表達(dá)水平的差異。
　　5.對(duì)長(zhǎng)毛品系W39和光葉品種LEMONT構(gòu)建的F2群體分析發(fā)現(xiàn)控制長(zhǎng)毛表型的HL6與控制光葉表型的Os WOX3B存在遺傳互作，HL6調(diào)控的長(zhǎng)毛表型依賴(lài)于有功能的Os WOX3B。EMSA和酵母單雜交的結(jié)果顯示OsWOX3B通過(guò)結(jié)合HL6的啟動(dòng)子直接調(diào)控HL6的轉(zhuǎn)錄。雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(BiFC)、酵母雙雜交和體外蛋白質(zhì)結(jié)合

7、分析的結(jié)果顯示HL6與OsWOX3B之間也存在蛋白互作，通過(guò)AP2和HD結(jié)構(gòu)域形成蛋白復(fù)合體，共同調(diào)控OsYUCCA5、OsPINla、OsARF4和OsARF7的表達(dá)，影響生長(zhǎng)素的含量和分布。HL6和OsWOX3B可以直接結(jié)合OsYUCCA5從而調(diào)控其表達(dá)，并且HL6與OsWOX3B之間的蛋白互作可以增強(qiáng)HL6蛋白與OsYUCCA5的結(jié)合能力。
　　6.高溫處理和失水速率的結(jié)果表明HL6控制的長(zhǎng)毛表型可以提高水稻幼苗對(duì)高溫的抗性

8、，降低葉片水分的蒸騰速率，對(duì)提高水稻的抗旱能力具有積極的作用;產(chǎn)量性狀的考察結(jié)果顯示HL6對(duì)水稻的產(chǎn)量有一定的抑制作用。
　　7.單倍型分析發(fā)現(xiàn)HL6在種質(zhì)中至少有10種單倍型，其中控制長(zhǎng)毛表型的HL6W39所在單倍型H10的頻率非常稀少。栽培稻中HL6的核酸多樣性只有野生稻的1/10，Tajima's D以及其他檢驗(yàn)的結(jié)果顯示HL6在秈稻中顯著的偏離了中性進(jìn)化的期望值，表明秈稻中控制長(zhǎng)毛表型的HL6W39來(lái)源于野生稻，在水稻馴化