控制水稻維管束發(fā)育基因TWI1的圖位克隆和功能研究.pdf

1、植物葉脈分布在葉肉組織中，對礦物質(zhì)、水分和光合作用產(chǎn)物的運(yùn)輸及葉片的物理支撐起著重要的作用。水稻的葉脈為平行脈，分為中脈、大脈與小脈。小脈的密度（即單位葉寬的小脈數(shù)）對于光合作用產(chǎn)物的運(yùn)輸尤其重要，C4植物的小脈密度要比C3植物高，因此具有更快的光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)速率。研究水稻小脈密度調(diào)控的分子機(jī)制不僅僅可以揭示維管束發(fā)生、發(fā)育等基礎(chǔ)理論問題，更重要的是可以通過改造水稻小脈密度，甚至在水稻中創(chuàng)制類似C4植物葉片的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，提高光合作用效率及

2、光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)速率，為C4水稻的創(chuàng)制打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　本論文以一份葉脈密度增加、維管束發(fā)育異常的類C4葉脈結(jié)構(gòu)突變體為研究對象，通過圖位克隆方法克隆控制該性狀的基因TWI1，并對TWI1調(diào)控水稻葉脈發(fā)育的分子機(jī)理進(jìn)行研究，主要結(jié)論如下:
　　1、水稻野生型日本晴旗葉中部小脈密度為每2mm葉寬9個(gè)小脈，本研究從大容量T-DNA插入突變體庫中篩選獲得了一份旗葉中部小脈密度為每2mm葉寬14個(gè)小脈的突變體，由于葉片同時(shí)表現(xiàn)為卷曲

3、，將其命名為twi1（twisted-leaf1）。該突變體葉片解剖學(xué)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為葉脈增密、兩個(gè)維管束之間的葉肉細(xì)胞數(shù)減少，維管束鞘細(xì)胞大而數(shù)目少，內(nèi)束鞘細(xì)胞缺失，非常類似C4植物的“花環(huán)結(jié)構(gòu)”。組織解剖學(xué)研究表明twi1突變體在維管束形成時(shí)候的木質(zhì)化進(jìn)程發(fā)生異常，從而導(dǎo)致形成發(fā)育不完全的葉脈結(jié)構(gòu)。
　　2、利用圖位克隆法克隆到TWI1基因，該基因編碼一個(gè)由591個(gè)氨基酸組成，含有RCD-SRO-TAF4保守結(jié)構(gòu)域的自由基誘導(dǎo)細(xì)胞死

4、亡蛋白;基因測序結(jié)果表明，twi1突變體中該基因第一個(gè)外顯子發(fā)生單堿基替換(T-A)產(chǎn)生終止密碼子，導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止。TWI1為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合蛋白，亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明該蛋白定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)該基因在幼苗期植株和成熟期的根、莖、葉、花和穎殼均有表達(dá)，并且在幼苗期和成熟期的葉片表達(dá)量較高。突變體互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)中，TWII可以完全恢復(fù)twi1突變體表型，進(jìn)一步驗(yàn)證了該基因的功能。
　　3、利用酵母雙雜交篩庫獲得了TWI

5、1互作蛋白OSH15，并利用雙分子熒光互補(bǔ)和免疫共沉淀在植物體內(nèi)證明TWI1與OSH15的體內(nèi)相互作用。對基因TWI1和OSH15的不同功能域分別進(jìn)行酵母點(diǎn)對點(diǎn)互作分析，結(jié)果表明，TWI1的RST功能域和OSH15的HD功能域是TWI1和OSH15互作的核心功能域，負(fù)責(zé)兩個(gè)蛋白的相互作用。蛋白2A自剪切系統(tǒng)注射煙草實(shí)驗(yàn)表明，OSH15蛋白可以穿梭移動到相鄰細(xì)胞，同時(shí)TWI1通過和OSH15相互作用而抑制其移動功能。同時(shí)擬南芥根毛拯救實(shí)驗(yàn)

6、結(jié)果顯示，GL1-OSH15融合蛋白可以從突變體gl1葉肉細(xì)胞中移動到表皮細(xì)胞，互補(bǔ)其葉毛缺失表型，再次證明OSH15具有細(xì)胞間穿梭移動功能，并且共表達(dá)TWI1轉(zhuǎn)基因株系中OSH15移動能力被抑制。
　　4、利用免疫組化實(shí)驗(yàn)研究了OSH15蛋白在野生型和twi1組織內(nèi)分布情況，結(jié)果表明，OSH15蛋白在野生型中僅在頂端分生組織葉原基部位存在，而突變體中OSH15蛋白不僅在頂端分生組織彌散分布，同時(shí)在葉片也有存在，證明OSH15蛋白