水稻分蘗基因ext-M1B圖位克隆和功能研究.pdf

1、水稻是重要的糧食作物，提高水稻的產(chǎn)量，是育種家和生物技術(shù)工作者共同的使命。分蘗是水稻生長的基本特性，是影響稻米產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀之一。因此，對水稻分蘗的研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。隨著遺傳學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法的迅猛發(fā)展，一些參與分蘗的相關(guān)基因相繼被克隆。為進(jìn)一步闡明水稻分蘗復(fù)雜的分子機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)
　　 從水稻保持系綿香1B(M1B)和一份雄性核不育材料(Genetic Male Sterile, GMS-1)

2、的雜交F2代中發(fā)現(xiàn)一株極度分蘗突變體，命名為M1B-ext。用突變體和野生型水稻品種2480B、D62B、G46B、G683B、M1B進(jìn)行正反交配制雜交組合構(gòu)建F2群體。對所配制的雜交組合進(jìn)行遺傳分析發(fā)現(xiàn)，無論正交還是反交，所有組合F1代株系均表現(xiàn)為正常親本的表型；F2代表型統(tǒng)計(jì)和x2測驗(yàn)表明，正常植株與突變體的比例符合一對基因控制的分離比3:1，表明該突變體突變性狀受單隱性核基因控制。
　　 通過分子標(biāo)記的連鎖分析將水稻多分蘗

3、基因ext-M1B定位在第6染色體短臂SSR分子標(biāo)記RM19398和RM510之間51.8kb區(qū)間內(nèi)區(qū)域內(nèi)。通過生物信息學(xué)分析這一區(qū)域內(nèi)的水稻基因組數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)一個與擬南芥中抑制分枝的基因MAX2高度同源的基因（暫命名為OsMAX2)，該基因編碼F-box蛋白和具有LRR重復(fù)氨基酸序列結(jié)構(gòu)域。對突變體上該等位基因進(jìn)行DNA測序發(fā)現(xiàn)，在這個基因編碼區(qū)1012位點(diǎn)上GAT突變成為GCCT,該突變導(dǎo)致翻譯移碼，使蛋白質(zhì)在第372個氨基酸位置

4、提前終止。因此確定OsMAX2為ext-M1B候選目的基因。
　　 利用實(shí)時定量熒光PCR對ext-M1B基因mRNA在根、莖、葉的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了分析，結(jié)果表明該基因在葉片中的轉(zhuǎn)錄水平最高，在莖中的表達(dá)量略高于根部。我們推測ext-M1B基因的調(diào)控很可能發(fā)生在水稻多個組織中，很可能是作用于一種根部到莖部最后到達(dá)植物葉片的一種可移動的物質(zhì)（獨(dú)角金內(nèi)酯）。
　　 有研究表明，MAX2基因參與了擬南芥獨(dú)角金內(nèi)酯抑制分蘗的途徑。

5、為了研究ext-M1B基因是否參與水稻中獨(dú)角金內(nèi)酯途徑抑制分蘗的途徑，我們對相關(guān)基因在M1B-ext突變體和野生型的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了分析，結(jié)果表明在突變體中D10,D27、HTD1在轉(zhuǎn)錄水平上與野生型相比均有一定程度的降低，而D14基因在突變體中的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于野生型。由此可見，ext-M1B可能與這4個基因共同參與獨(dú)角金內(nèi)酯途徑抑制水稻分蘗。
　　 為了驗(yàn)證候選基因OsMAX2是否為目的基因，我們根據(jù)水稻基因組序列信息設(shè)計(jì)引物

6、，利用PCR擴(kuò)增出候選基因。最終構(gòu)建了候選基因OsMAX2的過量表達(dá)載體pHB-ext和干涉表達(dá)載體pOsAct-RNAi。通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)化水稻，得到轉(zhuǎn)基因植株。功能驗(yàn)證試驗(yàn)還在進(jìn)行中。
　　 綜上所述，我們對一份極度分蘗突變體M1B-ext進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該極度分蘗突變體受單隱性核基因(ext-M1B)控制，OsMAX2可能為候選目的基因，同時，我們認(rèn)為OsMAX2可能參與了水稻獨(dú)角金內(nèi)酯抑制分蘗途徑的調(diào)