棉花轉(zhuǎn)基因體系的優(yōu)化和抗黃萎病基因的轉(zhuǎn)化.pdf

1、棉花黃萎病是棉花生長過程中一種最具破壞力的真菌病害，在世界范圍內(nèi)流行。該病害不僅嚴(yán)重影響棉纖維產(chǎn)量，降低幅度達(dá)20-60％，而且能大幅度降低棉纖維的品質(zhì)。棉花黃萎病已經(jīng)成為世界上棉花生產(chǎn)的主要障礙。利用遺傳工程技術(shù)改良棉花品種可以提高棉花的抗病性。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是目前應(yīng)用最廣泛、轉(zhuǎn)化機(jī)理最清楚的基因轉(zhuǎn)化方法。然而，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花基因轉(zhuǎn)化存在很多問題，如棉花組織培養(yǎng)的基因型依賴性、轉(zhuǎn)化效率低、轉(zhuǎn)基因植株基因表達(dá)沉默等等，這些問題已經(jīng)成為棉

2、花基因工程研究領(lǐng)域的障礙和瓶頸。本研究主要以陸地棉品系5983為材料，優(yōu)化了組織培養(yǎng)體系和基因轉(zhuǎn)化體系，將從苜蓿種子中克隆的苜?？咕幕?qū)氲矫藁ㄖ校?jīng)檢測獲得了抗黃萎病的轉(zhuǎn)基因棉花。 棉花纖維的生長發(fā)育是依賴于一系列基因的調(diào)控。但由于棉花基因遺傳轉(zhuǎn)化需要大量的人力和物力，轉(zhuǎn)化和生長周期長，大規(guī)模進(jìn)行棉纖維基因功能分析非常困難，基因是如何調(diào)控棉纖維的生長發(fā)育還不是很清楚。因此，有必要建立一套快速簡單的棉纖維基因功能鑒定的瞬時(shí)表

3、達(dá)方法。本研究以GUS為報(bào)告基因，采用棉花胚珠離體培養(yǎng)技術(shù)，基因槍轉(zhuǎn)化、子房注射法，建立了兩套外源基因轉(zhuǎn)化棉纖維的瞬時(shí)表達(dá)體系。 將取得的研究成果歸納如下： 1.棉花組織培養(yǎng)體系的優(yōu)化。 以5-7日苗齡無菌苗下胚軸切段為外植體，在以LS和MSB培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，共15種不同激素配比培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，結(jié)果表明，不同培養(yǎng)基類型和激素組合對愈傷組織的誘導(dǎo)都有重要的影響。同樣激素處理?xiàng)l件下，LS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的愈傷

4、組織要好于MSB培養(yǎng)基，愈傷組織大都為黃綠色，具有分化為胚性愈傷組織的潛力。在所有的激素組合中，在含0.1mg/L KT和0.2mg/L 2,4-D的LS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)的愈傷組織最好，顏色為黃綠色，質(zhì)地松軟。而其他組合的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的愈傷組織則呈白色硬塊或褐色稀泥狀，分化為胚性愈傷組織的潛力小。將獲得的愈傷組織繼代到四種不同的培養(yǎng)基上，在MSB培養(yǎng)基上增殖的愈傷組織的色澤和質(zhì)地要好于LS培養(yǎng)基上的愈傷組織。在MSB培養(yǎng)基上增殖的大部分愈傷

5、組織為淡綠色或粉紅色，而LS培養(yǎng)基上增殖的愈傷組織則是白色硬塊愈傷。ZT或活性炭的加入降低了愈傷組織的增殖速度。將在MSB培養(yǎng)基上增殖的愈傷組織轉(zhuǎn)移到6種含不同激素種類及配比的MSB培養(yǎng)基上。結(jié)果表明，0.3mg/L KT和0.5mg/L IBA組合的效果優(yōu)于其他組合，在這個(gè)培養(yǎng)基上產(chǎn)生的子葉胚數(shù)和總胚數(shù)最多.獲得的胚狀體放在含0.5mg/LNAA的1/2MSB培養(yǎng)基上誘導(dǎo)綠苗形成。5μmol/LNi2+和Zn2+能促進(jìn)胚性愈傷組織的分

6、化和綠苗的萌發(fā)。待幼苗長到5-8cm時(shí)，采用直接移栽和嫁接移栽的方法將苗移到溫室。 2.棉花轉(zhuǎn)基因體系的優(yōu)化。 以含質(zhì)粒pCAMBIA1301的農(nóng)桿菌介導(dǎo)棉花下胚軸切段，50mg/L的潮霉素加入到培養(yǎng)基中篩選抗性愈傷組織，優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化的影響因子。研究結(jié)果表明：不同農(nóng)桿菌菌種對棉花的浸染能力不同，在三種農(nóng)桿菌菌種中，農(nóng)桿菌LBA4404的浸染能力最強(qiáng)。農(nóng)桿菌菌液濃度OD600值在0.5-0.7時(shí)，培養(yǎng)基中

7、加200μmol/L乙酰丁香酮，浸染10-15min，在50mg/L潮霉素培養(yǎng)基篩選后，愈傷組織轉(zhuǎn)化率最高。共培養(yǎng)溫度和時(shí)間對愈傷組織轉(zhuǎn)化率也有明顯的影響.研究表明在共培養(yǎng)溫度21℃下，共培養(yǎng)60 h，轉(zhuǎn)化效果最好。 3.植物表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)基因棉花的篩選。 從苜蓿種子中克隆了已知基因苜蓿抗菌肽基因(alfAFP)，并將其連接到質(zhì)粒pCAMBIA1301中.基因的表達(dá)由CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng).用已經(jīng)優(yōu)化的基因轉(zhuǎn)化體系

8、進(jìn)行目的基因轉(zhuǎn)化，待再生苗5-8cm高時(shí)，將其直接移栽到溫室，最后共得到15顆再生植株。經(jīng)潮霉素涂抹，發(fā)現(xiàn)有3株是假陽性植株。對其余12個(gè)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子檢測，PCR結(jié)果表明在12個(gè)轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA中都有目的基因存在，而在對照植株的基因組DNA中檢測不到目的基因的存在。隨后，為檢測外源基因在棉花基因組中的整合，對這12個(gè)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行Southern檢測.結(jié)果表明，在12個(gè)轉(zhuǎn)化植株中都能檢測到Southern雜交信號，有6株是單

9、拷貝整合，另外6株是雙拷貝整合。提取12個(gè)轉(zhuǎn)基因植株根部的RNA，Northern檢測都有雜交信號，說明外源DNA在轉(zhuǎn)基因植株根部都有轉(zhuǎn)錄。 4.轉(zhuǎn)基因棉花的抗病性鑒定、生理特性表現(xiàn)和農(nóng)藝性狀表現(xiàn)。 離體抗病檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化植株葉片粗提液的處理產(chǎn)生的菌落數(shù)顯著(P<0.01)少于對照，大麗輪枝菌的生長被抑制46.2-86.8％，表明外源抗菌肽在轉(zhuǎn)基因棉葉中含量較高。 為鑒定轉(zhuǎn)基因植株的抗病性，用50ml大麗輪枝

10、菌孢子懸浮液接種轉(zhuǎn)基因植株和對照植株的根部。在成熟期調(diào)查黃萎病的發(fā)病級別。結(jié)果表明，12個(gè)轉(zhuǎn)基因植株中，有5株是黃萎病免疫株，有3株為1級發(fā)病，3株是2級發(fā)病，有1株發(fā)病嚴(yán)重，是3級。離體抗病檢測和轉(zhuǎn)基因植株接菌檢測結(jié)果都表明，alfAFP基因的導(dǎo)入不同程度的提高了棉花對黃萎病的抗性。 抗病鑒定的同時(shí)，本文測定了四個(gè)與抗病相關(guān)的酶在接菌后的活性變化。四個(gè)酶活性的變化趨勢相同.對照植株接菌后酶活性有一個(gè)快速升高和快速降低的過程。轉(zhuǎn)

11、基因植株中，部分抗性植株酶活性變化也有一個(gè)升高和降低的過程，但變化幅度較小，而黃萎病免疫植株的酶活性變化則相當(dāng)平緩，沒有明顯的峰值。 外源基因的導(dǎo)入對棉花農(nóng)藝性狀也有較大的影響。轉(zhuǎn)基因植株株高普遍降低，果枝數(shù)，果節(jié)數(shù)和鈴數(shù)顯著減少，鈴重大大降低，但對衣分的影響不大。在纖維品質(zhì)性狀中，纖維比強(qiáng)度下降，馬克隆值有不同程度的增加，纖維長度的變化不一致，有的增長，有的變短。 5.棉纖維基因轉(zhuǎn)化的瞬時(shí)表達(dá)體系的建立。 1D

12、PA胚珠預(yù)培養(yǎng)1d后，用基因槍轟擊，在轟擊壓力1100psi，射程9cm，真空度28英寸汞柱，質(zhì)粒用量為2μg/槍的條件下，GUS染色瞬時(shí)表達(dá)效果最好。轟擊后GUS染色表明，該基因可以在纖維發(fā)育的第3-22天持續(xù)表達(dá)，即該轉(zhuǎn)化體系可以檢測纖維發(fā)育第3-22天內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)。 子房注射法轉(zhuǎn)化外源基因，質(zhì)粒濃度為0.04-0.07μg/μl之間時(shí)轉(zhuǎn)化效果最好。注射開花后1DPA子房，胚珠GUS染色表明，注射后第3天的GUS表達(dá)率最