棉花抗黃萎病新種質創(chuàng)制及黃萎病菌脅迫后D基因組熱激蛋白70基因家族的表達分析.pdf

1、棉花屬于全球最重要的經濟作物，是紡織工業(yè)原料、食用油和飼料蛋白的重要來源。棉花生長發(fā)育過程中經常遭受逆境脅迫的影響，引起產量、纖維品質和植棉效益的多重損失，因此提高棉花抗生物逆境、非生物逆境脅迫的能力顯得尤其重要。棉花生育期內會受到枯萎病、黃萎病、棉鈴蟲、棉蚜和盲蝽蟓等生物逆境的脅迫，通過遺傳改良，目前推廣品種已經具備對枯萎病、棉鈴蟲和棉蚜的抗性，而黃萎病的防治至今仍然是一項技術難題，由于頻繁發(fā)生引起嚴重的產量損失，在棉花生產上被稱為“

2、癌癥”。棉花黃萎病為真菌性的維管束病害，通過種子、土壤、病株殘體和棉籽殼以及棉籽餅傳播。棉花抗黃萎病育種進展緩慢的原因在于病原菌生理小種的變異和主栽棉種陸地棉中嚴重缺乏高抗水平的抗源。本研究采用植物基因工程手段和棉花遠緣雜交技術，將天麻抗真菌蛋白基因和棉屬野生種抗黃萎病性狀轉育到陸地棉遺傳背景中，開展棉花抗黃萎病新種質的創(chuàng)制，并利用已獲得的高抗黃萎病種質系為材料，結合最近釋放的雷蒙德氏棉全基因組信息以及不同棉種EST序列信息，進行棉花D

3、基因組中Hsp70基因的鑒定、分類和黃萎病菌誘導后的表達分析，從而為我國棉花抗黃萎病育種提供高效抗源，并為棉花抗黃萎病基因的表達調控以及棉花抗黃萎病機制的研究奠定理論基礎。主要研究結果如下:1轉天麻抗真菌蛋白基因提高棉花對黃萎病的抗性
　　天麻抗真菌蛋白基因（gastrodia antfungal protein，gafp）是一個從天麻體內克隆得到的抗病基因，其開放閱讀框全長為540bp，編碼179個氨基酸，GenBank登錄號A

4、F225410。本研究利用pBI121質粒載體為基礎構建CaMV35S啟動子驅動的gafp基因植物高效表達載體，通過農桿菌介導法轉化陸地棉高頻再生品系蘇研060，培育出22個轉gafp基因純合系。Southern blotting結果表明，每1個轉基因植株體內有1-2個拷貝gafp基因整合到棉花基因組中。RT-PCR分析、Western blotting等分子檢測結果證明，gafp基因在16個純合系中能夠正確地實現轉錄和翻譯，目的基因已

5、經整合到棉花基因組中，并能夠穩(wěn)定地產生表達產物天麻抗真菌蛋白。通過溫室苗期接菌鑒定與網室成株期病土鑒定，篩選獲得3個抗黃萎病的棉花新種質系TG809、TG816、TG823，這3份新種質對落葉型黃萎病菌系V991的抗性穩(wěn)定達到抗級。研究結果表明，gafp基因轉化陸地棉能夠顯著提高棉花對黃萎病的抗性。
　　2陸地棉背景野生棉染色體片段代換系培育與抗黃萎病種質資源發(fā)掘
　　通過陸地棉與異常棉、辣根棉、旱地棉、雷蒙德氏棉、黃褐棉等

6、野生棉的遠緣雜交和回交等，育成65份陸地棉背景的野生棉染色體片段代換系。兩年性狀鑒定結果表明，野生棉染色體片段代換系的株高平均值與陸地棉品種處于相同水平，單株果枝數、單株果節(jié)數、單株結鈴數、鈴重、衣分平均值均低于陸地棉品種。其中辣根棉、雷蒙德氏棉染色體片段代換系的單株結鈴數高于旱地棉、異常棉、黃褐棉染色體片段代換系;黃褐棉、辣根棉染色體片段代換系的鈴重平均值高于旱地棉、異常棉、雷蒙德氏棉染色體片段代換系;辣根棉、雷蒙德氏棉、黃褐棉染色體

7、片段代換系的衣分平均值高于異常棉、旱地棉染色體片段代換系。異常棉、辣根棉、旱地棉、雷蒙德氏棉、黃褐棉染色體片段代換系單株皮棉產量水平低，僅占陸地棉推廣品種的44.17％-64.16％。野生棉染色體片段代換系纖維長度、比強度、細度與成熟度搭配合理，大多數品系的纖維適宜紡80支以上的特高支紗，目前大面積推廣的陸地棉品種主要纖維品質指標搭配不合理，比強度普遍偏低，大多數品種只能紡中低支紗，不能滿足棉紡織工業(yè)的用棉需求。根據連續(xù)兩年落葉型黃萎病

8、菌系V991人工病圃抗病性鑒定結果，從65份陸地棉背景的野生棉染色體片段代換系中，獲得5份抗黃萎病的棉花新種質系，其中蘇遠040、蘇遠045、蘇遠061病情指數分別為8.33、4.35、7.79，高抗黃萎病，蘇遠030、蘇遠034病情指數分別為12.35、13.70，抗黃萎病。追蹤陸地棉抗黃萎病新種質系的親緣關系發(fā)現，蘇遠040、蘇遠045為雷蒙德氏棉染色體片段代換系，蘇遠061為黃褐棉染色體片段代換系，蘇遠030、蘇遠034為旱地棉染

9、色體片段代換系。這些高品質纖維、抗黃萎病新種質的育成，拓寬了陸地棉的遺傳基礎，為我國棉花新品種選育實現多目標性狀的同步改良提供了骨干親本。
　　3棉花D基因組熱激蛋白70基因的鑒定與黃萎病菌脅迫后的表達分析
　　熱激蛋白(HSP，heat shock protein)是細胞受到不利環(huán)境刺激時被激活并增強表達的一類蛋白，其中HSP70在植物逆境脅迫應答、分子伴侶作用及其提高植物抗逆性的過程中發(fā)揮著重要作用。根據表達特性可將HS

10、P70家族分為HSC70和HSP70，前者屬于結構型HSP，在所有細胞內都能表達，同時也受一定程度的熱誘導;后者屬于誘導型HSP，在正常情況下很少表達或不表達，而在熱刺激或其它環(huán)境脅迫下表達量迅速增強。本研究利用最近釋放的雷蒙德氏棉全基因組序列信息，對棉花D基因組中的Hsp70基因家族進行鑒定、分類和系統(tǒng)進化分析。結果表明，共獲得30個Hsp70基因，這些基因非均勻性地分布在棉花D基因組染色體上，在D4、D7染色體上沒有分布，同時發(fā)現1

11、2個Hsp70基因以不同組合方式成簇分布在D6、D9、D11和D12染色體上。參照擬南芥Hsp70基因的分類方法，將棉花D基因組30個Hsp70基因分為兩個家族，其中24個屬于DnaK基因家族，6個屬于Hsp110/SSE基因家族。根據亞細胞定位結果，將棉花D基因組30個Hsp70基因分為6個亞組。其中第1亞組11個，定位于細胞質基質;第2亞組5個，定位于內質網;第3亞組3個，定位于線粒體;第4亞組3個，定位于葉綠體;第5亞組兩個，未能

12、定位于亞細胞結構;第6亞組6個，屬于Hsp110/SSE基因家族，定位于細胞質基質。利用蘇遠045、海7124和TM-1為供試材料，其中蘇遠045高抗黃萎病，海7124抗黃萎病，TM-1感黃萎病。在落葉型黃萎病菌系V991脅迫條件下，開展棉花Hsp70基因的表達特征研究。結果表明，除Hsp70-07、Hsp70-16、Hsp70-25和Hsp70-26基因的表達不受黃萎病菌誘導外，其它26個Hsp70基因均受黃萎病菌的誘導而上調表達，H

13、sp70基因在棉花黃萎病脅迫應答過程中發(fā)揮著重要作用。受黃萎病菌誘導24h后，Hsp70-02、Hsp70-08、Hsp70-09、Hsp70-18、Hsp70-19、Hsp70-30基因在蘇遠045體內高效表達;Hsp70-08、Hsp70-10、Hsp70-11、Hsp70-18、Hsp70-30基因在海7124體內高效表達，這些Hsp70基因可能與棉花抗黃萎病的入侵有關。接種黃萎病菌144h后，Hsp70-13、Hsp70-14、