棉花在黃萎病侵染早期的蛋白質(zhì)組及表達譜分析.pdf

1、棉花作為主要的紡織工業(yè)原料,是最重要的經(jīng)濟作物。棉花黃萎病作為一種維管束病害,每年對棉花生產(chǎn)造成的損失巨大。我們對黃萎病菌(Verticilliumdahliae)致病的分子機理了解的并不多。歷史上對黃萎病致病機理存在兩種看起來相互沖突的觀點:一種認為黃萎病是由于真菌分泌的毒素導(dǎo)致的,另一種則認為黃萎病菌導(dǎo)致的維管束堵塞才是導(dǎo)致病害的原因。
　　 為了深入了解棉花與黃萎病菌相互作用的分子機制,本論文利用蛋白質(zhì)組學(xué)及表達譜學(xué)來探討

2、棉花在黃萎病菌侵染早期的變化。在建立有效接菌體系及蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析基礎(chǔ)上,對強致病型V.dahliae侵染早期的棉花差異蛋白質(zhì)組學(xué)進行了研究。而V.dahliae按照致病類型可以分為強中弱三種,為了解釋弱致病型V.Dahliae侵染后,棉花無病理癥狀的原因,使用Solexa測序表達譜學(xué)技術(shù)分析了棉花根部的差異表達基因。
　　 1.適于棉花幼苗蛋白質(zhì)組研究的總蛋白質(zhì)提取方法的建立
　　 為了找到一種適合棉花幼苗的蛋白質(zhì)提

3、取方法,對四種常用的植物蛋白質(zhì)提取方法進行比較。結(jié)果表明:三氯乙酸-丙酮及酚提取法(Method D)提取的蛋白最優(yōu),在雙向電泳(2D)凝膠上的蛋白點也最多(321);丙酮-酚提取法(MethodB)提取的蛋白在2D凝膠上顯示出216個蛋白點;三氯乙酸-丙酮(Method A)提取法則不適于棉花的蛋白質(zhì)提取,僅僅有少許的低分子量蛋白出現(xiàn)在2D凝膠上;酚提取法(Method C)提取的蛋白在2D凝膠上顯示出240個點,但其凝膠背景較高。因

4、此我們選擇Method D,并對其進行了優(yōu)化。利用優(yōu)化的Method D提取的棉花總蛋白,通過雙向電泳后,用考馬斯亮藍G-250染色在2D凝膠上可見900多個蛋白點,蛋白點數(shù)比優(yōu)化前增加了約3倍。以上結(jié)果表明優(yōu)化后的Method D更加適合棉花幼苗的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。
　　 優(yōu)化的Method D方法為:首先使用三氯乙酸-丙酮沉淀蛋白質(zhì),去除色素等有機物質(zhì)。然后進行洗滌,使用酚抽兩次提蛋白樣品減少蛋白損失,接著使用提取液抽提酚相去

5、除可能的水溶性物質(zhì)。最后使用醋酸銨甲醇溶液沉淀蛋白質(zhì),并使用甲醇與80％丙酮分別洗滌兩次。
　　 用優(yōu)化的Method D提取V.dahliae侵染前后的棉花葉片總蛋白,然后進行差異蛋白質(zhì)組分析。其中一個差異蛋白點Flavanone3-hydroxylase(F3H)表現(xiàn)出明顯的上調(diào)表達,進一步的實驗證明傷處理棉花后F3H下游與Proanthocyanidins(Pas)合成相關(guān)的基因多表現(xiàn)為協(xié)同性的上調(diào)表達。這些結(jié)果表明Pas

6、可能在V.dahliae侵染與傷誘導(dǎo)的棉花中扮演重要作用。然而實驗也表明V.dahliae侵染后,棉花葉片差異蛋白較少。棉花根部可能是更好的V.dahliae與棉花互作研究材料,因為V.dahliae侵染是從根部開始。
　　 2.V.dahliae侵染早期,棉花根組織的差異蛋白組學(xué)研究
　　 在優(yōu)化的Method D基礎(chǔ)上,建立了一個適合棉花根部蛋白組提取方法。V.dahliae侵染棉花后棉花根部組織材料在0 h,24

7、h與72 h分別被收集,并提取蛋白質(zhì)進行雙向電泳,平均有830±11蛋白點在凝膠上被檢測到。進一步通過質(zhì)譜鑒定了34個差異表達蛋白的肽指紋圖譜(Peptide-mass fingerprinting,PMF)。因為缺乏棉花的基因組序列,我們在數(shù)據(jù)鑒定時以高等植物的數(shù)據(jù)庫為比對數(shù)據(jù)庫。有15個蛋白點被鑒定,其中1個上調(diào)表達,10個下調(diào)表達,4個表現(xiàn)為臨時上調(diào)表達。按照功能分,這些蛋白包括病原相關(guān)蛋白、活性氧(Reactive oxygen

8、 species,ROS)調(diào)節(jié)蛋白、折疊與修飾相關(guān)蛋白、糖與能量代謝相關(guān)蛋白及一些其它蛋白。
　　 總的來看,棉花受V.dahliae侵染后,首先建立早期的防御反應(yīng)(如PR蛋白及ROS)。然而這并不足以有效保護棉花,V.dahliae可能通過抑制或者破壞防御相關(guān)基因的表達從而成功侵入棉花,棉花的正常生理功能很快被破壞,一些蛋白表現(xiàn)為明顯的下調(diào)(如糖與能量代謝相關(guān)蛋白,折疊與修飾相關(guān)蛋白及細胞骨架蛋白)。
　　 3.與活性

9、氧及細胞死亡相關(guān)的毒素抑制試驗
　　 前述蛋白質(zhì)研究表明棉花受V.dahliae侵染后,早期的一個防御反應(yīng)與ROS相關(guān),在此通過植物組織染色進一步證實了V.dahliae的侵染導(dǎo)致棉花微管組織內(nèi)的ROS及細胞死亡。進一步的實驗還表明V.dahliae的上清液單獨就能導(dǎo)致葉片的萎焉壞死。
　　 為了驗證V.dahliae毒素誘導(dǎo)的細胞死亡是否是通過主動調(diào)控植物而造成的,我們通過蛋白合成抑制劑(Cycloheximide,C

10、HX)注射煙草葉片,實驗表明CHX能有效延遲毒素導(dǎo)致的葉片壞死斑形成。然而ROS抑制劑(Diphenyleneiodoniumchloride,DPI)及蛋白酶體抑制劑(Z-Leu-Leu-Leu-al,MG132)并不能阻止毒素導(dǎo)致的葉片壞死。這些結(jié)果告訴我們V.dahliae毒素是通過積極調(diào)控宿主蛋白質(zhì)的合成來誘導(dǎo)植物細胞死亡的,但這些調(diào)控并不是已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)的活性氧突發(fā)或者泛素/26S蛋白酶體途徑(ubiquitin/26S pro

11、teasome system)。
　　 此外,V.dahliae毒素能在老葉片上快速導(dǎo)致細胞壞死,而在嫩葉片上則不能,這表明V.dahliae毒素導(dǎo)致的細胞壞死也與葉片的年齡有關(guān)。這與V.dahliae導(dǎo)致的葉片萎焉壞死癥狀是從植株底部的老葉片開始往頂端嫩葉片擴展的病理癥狀是一致的。
　　 4.弱致病V.dahliae侵染棉花后,棉花根部組織的表達譜分析
　　 弱致病V.Dahliae菌株侵染棉花后,并不能導(dǎo)致棉

12、花產(chǎn)生明顯的病理癥狀,然而通過PCR能夠檢測到V.dahliae已經(jīng)進入棉花幼苗的根與莖中。在表達譜分析前,基于Solexa測序技術(shù)對RNA樣本質(zhì)量的要求,而實驗室已有的實驗方法提取的棉花根部組織RNA并不能滿足要求,因此通過比較幾種提取方法,我們選擇并優(yōu)化了一種質(zhì)量可靠的棉花根部組織RNA提取方法。
　　 提取V.dahliae侵染72 h后棉花根部組織的RNA樣品,通過Solexa測序,以對照組(Control)樣品得到的基

13、因表達豐度信息為對照,分析實驗組(Treatment)樣品基因的相對表達豐度,共有2681個表達上調(diào)或下調(diào)的差異基因,其中包含1017個上調(diào)表達基因與1664個下調(diào)表達基因。
　　 對差異表達基因進行KEGG Pathway顯著性富集分析后發(fā)現(xiàn)。這些差異表達基因包含在4條上調(diào)表達通路與3條下調(diào)表達通路中。這些上調(diào)表達通路包括:1),黃酮(Flavone)與黃酮醇(Flavonol)代謝通路;2),類黃酮類物質(zhì)(Flavonoid

14、)代謝通路;3),外芪類化合物(Stilbenoid),二芳基庚醇(Diarylheptanoid)及姜辣素(Cringerol)合成代謝途徑,這幾條通路的產(chǎn)物已經(jīng)被證明具有抗氧化、抗微生物的性質(zhì);4),細胞色素P450單加氧酶外源物質(zhì)代謝(Metabolism of xenobiotics)通路,該通路參與代謝細胞外有毒物質(zhì)。下調(diào)表達通路包括:1),核糖體(Ribosome)相關(guān)通路;2),剪切體(Spliceosome)相關(guān)通路,S

15、pliceosome與Ribosome分別參與基因的表達與蛋白翻譯過程,這兩個通路相關(guān)基因的下調(diào)表達表明,在V.dahliae的侵染下,植物本身的正常生理功能可能已被破壞,這個結(jié)論與棉花被弱致病菌侵染后表現(xiàn)的癥狀一致(棉花側(cè)根嚴重壞死);3),甾族化合物(Steroid)代謝通路,該通路代謝產(chǎn)物能促進植物組織分化及生長,然而Steroid通路與病原菌互作的相關(guān)報道很少,因此我們使用Realtime-PCR驗證該通路中一些基因的表達變化,