地克珠利對(duì)柔嫩艾美耳球蟲乳酸脫氫酶特性的影響研究.pdf

1、柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella，Et)是隸屬于頂器復(fù)合門(Apicomplexa)艾美耳屬的一種胞內(nèi)寄生性原蟲，可引起雞急性盲腸球蟲病，嚴(yán)重時(shí)可致雞只死亡。目前球蟲病的控制主要依賴抗球蟲藥物預(yù)防。地克珠利是一種三嗪類化合物，具有高效、低毒、廣譜的抗球蟲效力，但若長(zhǎng)期使用或使用不當(dāng)，會(huì)出現(xiàn)耐藥性。要防止或延緩耐藥性的發(fā)生，以及研制新的有效藥物，就必須了解該藥抗寄生蟲的分子作用機(jī)制，確定其靶標(biāo)分子。至今，關(guān)于地克珠利抗球蟲的

2、分子作用機(jī)制還不清楚。乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)是糖酵解途徑的末端酶，能夠催化丙酮酸與乳酸之間可逆的氧化還原反應(yīng)，大多數(shù)體內(nèi)寄生蟲依靠此途徑獲取能量維持生存。研究表明，E tenella地克珠利敏感株LDH（sEtLDH）與耐藥株LDH（rEtLDH）的同工酶譜存在明顯差異，提示EtLDH與地克珠利抗球蟲作用機(jī)理存在一定聯(lián)系。本研究通過(guò)sEtLDH與rEtLDH特性的差異比較、地克珠利對(duì)E.tene

3、lla孢子生殖及裂殖生殖過(guò)程中LDH的影響研究，為揭示地克珠利的分子作用機(jī)理及尋找潛在的藥物靶標(biāo)奠定了重要基礎(chǔ)。
　　1.EtLDH單克隆抗體的制各及其在蛋白定位中的應(yīng)用
　　用大腸桿菌表達(dá)的重組EtLDH可溶性蛋白免疫BALB/c小鼠，經(jīng)5次免疫后取脾臟制備免疫脾細(xì)胞，與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，用間接ELISA法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)3次亞克隆后獲得2株能穩(wěn)定分泌EtLDH單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2F7和2H4，抗體

4、亞類鑒定均為IgG1，腹水效價(jià)分別為1∶8000和1∶64000。Western blot檢測(cè)顯示2F7單抗能識(shí)別E.tenella第二代裂殖子中大小約為35 KDa的天然蛋白，利用該單抗對(duì)EtLDH在Etenella第二代裂殖子中的分布進(jìn)行定位，結(jié)果顯示EtLDH主要分布于裂殖子的細(xì)胞質(zhì)。研究表明成功制備了EtLDH單克隆抗體，為深入研究EtLDH的功能和特性奠定了基礎(chǔ)。
　　2.柔嫩艾美耳球蟲地克珠利敏感株與耐藥株LDH特性的

5、差異研究
　　克隆rEtLDH蛋白編碼區(qū)(Coding sequence，CDS)，經(jīng)測(cè)序和生物信息學(xué)分析，rEtLDH CDS為996 bp，編碼331個(gè)氨基酸，與sEtLDH僅在第914位有1個(gè)堿基的差異，編碼蛋白僅在第305位有1個(gè)氨基酸的差異;熒光定量PCR結(jié)果顯示，在球蟲4個(gè)不同發(fā)育階段（未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子）中，rEtLDH mRNA的相對(duì)含量在子孢子階段最高，且每個(gè)階段中sEtLDH mRN

6、A的相對(duì)含量都明顯高于相應(yīng)的rEtLDH(P＜0.01);Western blot結(jié)果表明，rEtLDH蛋白在第二代裂殖子階段的相對(duì)表達(dá)量比sEtLDH下降了55.32％(P＜0.01);建立了EtLDH催化反應(yīng)體系，正、逆反應(yīng)的最適溫度分別是50℃、40℃，最適pH分別為6.00、7.00，rEtLDH在孢子化卵囊的催化活力是sEtLDH的78.66％(P＜0.01)。結(jié)果表明，長(zhǎng)期的藥物誘導(dǎo)使EtLDH的特性發(fā)生了改變，地克珠利的作

7、用機(jī)理可能與LDH參與的糖酵解途徑有關(guān)。
　　3.地克珠利對(duì)柔嫩艾美耳球蟲孢子生殖過(guò)程LDH的影響研究
　　將純化的未孢子化卵囊平均分成兩組，藥物組用1×10-6地克珠利溶液懸浮后4℃孵育12h，對(duì)照組用等體積溶劑做相同處理。離心洗滌后，各組卵囊進(jìn)行孢子化培養(yǎng)72 h。孢子化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示藥物組卵囊的孢子化率為對(duì)照組的66.32％(P＜0.01);酶活力測(cè)定結(jié)果顯示藥物組EtLDH氧化反應(yīng)催化活力為對(duì)照組的44.39％(P＜0

8、.01)，而還原反應(yīng)催化活力為對(duì)照組的115.76％(P＜0.01);熒光定量PCR結(jié)果顯示藥物組EtLDH基因的轉(zhuǎn)錄水平為對(duì)照組的59.18％(P＜0.01);Western blot結(jié)果顯示藥物組EtLDH蛋白的翻譯水平為對(duì)照組的80.39％(P＜0.05)。推測(cè)地克珠利通過(guò)抑制糖酵解途徑中LDH的基因表達(dá)及酶活力來(lái)抑制球蟲的孢子生殖。
　　4.地克珠剩對(duì)柔嫩艾美耳球蟲裂殖生殖過(guò)程LDH的影響研究
　　將新鮮的孢子化卵囊

9、接種2周齡無(wú)球蟲雞，并分為藥物組和對(duì)照組。接種后第4d，藥物組按1 mg/kg體重的劑量嗉囊灌服地克珠利溶液，對(duì)照組嗉囊灌服相同劑量的藥物溶劑，繼續(xù)正常飲水采食。收集純化第二代裂殖子，酶活力測(cè)定結(jié)果顯示藥物組EtLDH氧化反應(yīng)催化活力為對(duì)照組的37.66％(P＜0.01)，而還原反應(yīng)催化活力為對(duì)照組的52.01％(P＜0.05);熒光定量PCR結(jié)果顯示藥物組EtLDH基因的轉(zhuǎn)錄水平為對(duì)照組的21.15％(P＜0.01); Western