不同途徑免疫NDV弱毒苗誘導(dǎo)雞體黏膜和系統(tǒng)免疫反應(yīng)的研究.pdf

1、雞新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一種急性、敗血性、高度接觸性傳染病，是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的最重要傳染病之一。目前，預(yù)防ND雖然有多種有效疫苗，但由于免疫途徑和免疫方法不當(dāng)?shù)仍颍率闺u群發(fā)生ND的現(xiàn)象不斷發(fā)生，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展造成了很大的損失。一般認(rèn)為系統(tǒng)免疫在雞抵抗NDV的感染中發(fā)揮主要作用，但在生產(chǎn)實(shí)踐中卻存在著雞體血清抗體水平高仍然發(fā)病

2、的現(xiàn)象，原因何在？有待探索。黏膜免疫是雞體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要組成部分，對(duì)雞體的局部免疫及全身免疫發(fā)揮著重要作用。長(zhǎng)期以來，關(guān)于NDV弱毒疫苗免疫的研究主要集中于全身系統(tǒng)免疫，而對(duì)特異性黏膜免疫的發(fā)生規(guī)律的研究較少，難以全面揭示NDV弱毒疫苗的免疫保護(hù)機(jī)理。因此，本研究對(duì)NDV弱毒苗經(jīng)不同黏膜途徑免疫雛雞后呼吸道和消化道等局部黏膜特異性抗體和抗體陽性細(xì)胞的的發(fā)生規(guī)律進(jìn)行了全面系統(tǒng)的研究，主要試驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 1.雞SI

3、gA的純化及其抗病毒活性
　　 首先應(yīng)用硫酸銨鹽析和聚乙二醇（PEG）沉淀粗提雞膽汁中的分泌型IgA（SIgA），再經(jīng)SephadeXG-200凝膠過濾和DEAE纖維素離子交換層析純化SIgA，并用SDS-PAGE電泳和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)其純度和活性，然后采用雞胚接種試驗(yàn)、雞胚病毒中和試驗(yàn)和攻毒治療試驗(yàn)，檢測(cè)雞SIgA的抗NDV活性，結(jié)果表明，純化的雞SIgA終濃度為3.8mg/mL，重鏈分子量約為67kD，輕鏈分子量約為28kD

4、；SIgA處理NDV后，能明顯降低雞胚尿囊液中NDV的血凝效價(jià)，與血清組差異不顯著(P>0.05)；雞SIgA的雞胚病毒中和指數(shù)為6.2，低于免疫血清；另外，用純化的SIgA治療攻毒的SPF雞，其治愈率為46.7％，同樣與血清治療組差異不顯著(P>0.05)；試驗(yàn)結(jié)果證明雞SIgA具有一定的中和NDV的能力。
　　 2.不同途徑免疫NDV弱毒苗誘導(dǎo)雞體黏膜和系統(tǒng)免疫發(fā)生規(guī)律的研究
　　 通過建立了檢測(cè)NDV特異性抗體的間

5、接ELISA方法,對(duì)7日齡SPF雞經(jīng)不同途徑免疫NDV弱毒苗后的血清、膽汁、呼吸道和消化道分泌液中NDV特異性SIgA、IgG和IgM的消長(zhǎng)規(guī)律進(jìn)行了檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)了血清HI抗體滴度。結(jié)果表明，點(diǎn)眼滴鼻免疫和飲水免疫雞的血清、膽汁、呼吸道和消化道分泌液中均可檢測(cè)到NDV特異性SIgA、IgG和IgM，其中：IgM在所有樣品中檢出時(shí)間最早，大部分于免疫后第3d檢測(cè)到，并于第7d達(dá)到高峰后迅速下降，是雞體早期抵抗NDV感染的主要抗體；IgG

6、大部分于免疫后第7d檢測(cè)到，并于第21d達(dá)到高峰，是血清的優(yōu)勢(shì)抗體；SIgA大部分于免疫后第7d檢測(cè)到，并于第28d達(dá)到高峰，在膽汁、呼吸道和消化道分泌液中抗體水平最高，且維持時(shí)間最長(zhǎng)，是NDV弱毒苗誘導(dǎo)雞膽汁、呼吸道和消化道分泌液中抗NDV的主要抗體。各組免疫雞不僅在誘導(dǎo)部位黏膜分泌液中產(chǎn)生高水平的特異性SIgA、IgG和IgM，而且在遠(yuǎn)端黏膜也產(chǎn)生抗體，表明雞的黏膜免疫類似哺乳動(dòng)物，也具有共同黏膜免疫的特點(diǎn)。點(diǎn)眼滴鼻免疫誘導(dǎo)的血清H

7、I抗體滴度和特異性SIgA、IgG和IgM抗體水平顯著高于飲水免疫，表明點(diǎn)眼滴鼻免疫誘導(dǎo)的系統(tǒng)體液免疫強(qiáng)于飲水免疫。點(diǎn)眼滴鼻免疫在氣管洗液和肺洗液誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性SIgA水平顯著高于飲水免疫，而飲水免疫在消化道洗液中誘導(dǎo)的特異性SIgA水平又顯著高于點(diǎn)眼滴鼻免疫，表明不同免疫途徑在各黏膜效應(yīng)位點(diǎn)誘導(dǎo)的黏膜免疫反應(yīng)的強(qiáng)度不同，點(diǎn)眼滴鼻免疫在呼吸道引起的黏膜免疫要強(qiáng)于飲水免疫，而飲水免疫在消化道的免疫強(qiáng)度要高于點(diǎn)眼滴鼻免疫。
　　

8、3．不同途徑免疫NDV弱毒苗誘導(dǎo)雞體黏膜和免疫器官中IgA、IgM和IgG陽性細(xì)胞變化規(guī)律的研究
　　 采用常規(guī)石蠟切片技術(shù)，優(yōu)化了各種反應(yīng)條件，建立了檢測(cè)免疫器官和局部黏膜IgA、IgM和IgG陽性細(xì)胞的間接免疫過氧化物酶組織化學(xué)染色法。應(yīng)用該法，對(duì)7日齡經(jīng)不同途徑免疫NDV弱毒苗的SPF雞脾臟、氣管、十二指腸、空腸、回腸、盲腸扁桃體和直腸中的IgA、IgM和IgG陽性細(xì)胞的分布規(guī)律和增殖規(guī)律進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，IgA、IgM

9、和IgG陽性細(xì)胞呈圓形或卵圓形，被染成深棕黃色，在脾臟中主要分布在邊緣區(qū)及紅髓的髓索中，在氣管中主要分布在氣管粘膜固有膜內(nèi)和氣管腺之間，在腸管中主要分布在腸絨毛固有層內(nèi)和腸腺之間。飲水和點(diǎn)眼滴鼻免疫均能誘導(dǎo)雞脾臟、呼吸道和消化道中產(chǎn)生IgA、IgM和IgG陽性細(xì)胞，其中脾臟中IgG陽性細(xì)胞數(shù)量最多，呼吸道和消化道黏膜中IgA陽性細(xì)胞數(shù)量最多。在免疫后的第21和28d，腸道黏膜固有層中IgA陽性細(xì)胞數(shù)量顯著多于IgM和IgG陽性細(xì)胞。在免

10、疫后第21-28d，點(diǎn)眼滴鼻免疫誘導(dǎo)的脾臟中IgG陽性細(xì)胞數(shù)量多于飲水免疫，但差異不顯著（P>0.05），而飲水免疫誘導(dǎo)的十二指腸、空腸、回腸和直腸黏膜中IgA陽性細(xì)胞數(shù)量多于點(diǎn)眼滴鼻免疫，但差異不顯著（P>0.05）。
　　 4.免疫抑制對(duì)NDV弱毒苗誘導(dǎo)的雞體黏膜免疫反應(yīng)的影響
　　 通過摘除法氏囊和注射環(huán)磷酰胺（CY）兩種方法造成1日齡SPF雞的免疫抑制,7日齡時(shí)用NDV弱毒苗經(jīng)飲水免疫試驗(yàn)雞，于免疫后不同時(shí)期檢測(cè)

11、各組雞免疫器官相對(duì)重量，外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量，血清HI抗體滴度，膽汁、氣管洗液、十二指腸洗液中NDV特異性SIgA水平以及小腸黏膜固有層中IgA陽性細(xì)胞的數(shù)量，比較兩種免疫抑制方法對(duì)系統(tǒng)免疫和黏膜免疫的影響。結(jié)果表明，兩種方法均能顯著降低血清HI抗體滴度，引起嚴(yán)重的系統(tǒng)體液免疫抑制，其中CY的抑制作用更強(qiáng)；兩種方法亦能顯著降低膽汁、氣管洗液和十二指腸洗液中NDV特異性SIgA抗體水平和小腸黏膜固有層中IgA陽性細(xì)胞的數(shù)量，特別在免疫后前3

12、周以內(nèi)抑制作用最明顯，從而也引起較嚴(yán)重的局部黏膜免疫反應(yīng)抑制；另外，NDV強(qiáng)毒攻毒試驗(yàn)表明局部黏膜免疫在抵抗NDV感染中發(fā)揮了一定的保護(hù)作用。
　　 5.免疫增強(qiáng)劑對(duì)NDV弱毒苗誘導(dǎo)的雞體黏膜免疫反應(yīng)的影響
　　 將NDV弱毒苗分別與CpG ODN、黃芪多糖（APS）、左旋咪唑（LMS）混合，并經(jīng)點(diǎn)眼滴鼻免疫14日齡雛雞，通過檢測(cè)免疫后各組雞的血清HI抗體滴度、局部分泌液中的特異性SIgA抗體水平，評(píng)價(jià)3種免疫增強(qiáng)劑對(duì)N

13、DV弱毒苗引起的黏膜和系統(tǒng)體液免疫反應(yīng)的增強(qiáng)作用。結(jié)果表明，在免疫后第3、4周,3種免疫增強(qiáng)劑均能提高血清HI抗體滴度，其中LMS的免疫增強(qiáng)作用強(qiáng)于CpG ODN和APS；3種免疫增強(qiáng)劑亦均能提高氣管洗液、十二指腸洗液、膽汁中NDV特異性SIgA抗體水平，其中CpG ODN序列的免疫增強(qiáng)作用強(qiáng)于APS和LMS；以上試驗(yàn)結(jié)果充分證明了3種免疫增強(qiáng)劑不僅能增強(qiáng)NDV弱毒苗引起的系統(tǒng)體液免疫應(yīng)答，而且也能較顯著增強(qiáng)黏膜免疫應(yīng)答反應(yīng)。綜上所述，