反向遺傳致弱的基因Ⅶ型NDV生物學(xué)特性及免疫效力研究.pdf

1、新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)引起多種禽類的傳染病，該病傳播速度快，引起高死亡率，是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的重要一類疫病。NDV屬于禽副粘病毒血清1型(APMV-1)，按照NDV F基因序列的差別可以將NDV分為至少16個(gè)基因型。各基因型毒株毒力有所差別，同時(shí)各基因型NDV之間具有抗原差異。當(dāng)前中國普遍使用的ND疫苗株多是基因Ⅰ型和Ⅱ型病毒株，但基因Ⅶ型

2、NDV為中國雞群廣泛流行強(qiáng)毒株，流行株和疫苗株之間存在抗原差異性，因此造成與流行毒株具有不同基因型的ND疫苗不能提供有效保護(hù)和阻止排毒。F蛋白是NDV重要的表面保護(hù)性抗原，介導(dǎo)NDV包膜與質(zhì)膜之間的相互融合等作用;L蛋白參與NDV基因組的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制。本研究利用基因工程技術(shù)先后對(duì)基因Ⅶ型NDV強(qiáng)毒株的F和L基因進(jìn)行突變，再利用NDV反向遺傳技術(shù)拯救獲得基因Ⅶ型NDV MG7株。接著對(duì)MG7株的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，鑒定MG7株的免疫原性，評(píng)

3、價(jià)其對(duì)SPF雞的保護(hù)效率，為NDV基因Ⅷ型反向遺傳疫苗提供科學(xué)數(shù)據(jù)，為ND的防控及ND新型疫苗的研究提供理論依據(jù)。
　　1.基因Ⅶ型NDV減毒株MG7的構(gòu)建及其生物學(xué)特性鑒定
　　以動(dòng)物病毒分子生態(tài)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)已經(jīng)構(gòu)建成功的基因Ⅶ型NDV強(qiáng)毒G7株的全基因組cDNA和輔助表達(dá)質(zhì)粒為基礎(chǔ)，通過Overlap方法將G7株的F蛋白裂解位點(diǎn)(112RRQKRF117)突變成NDV弱毒株F蛋白的裂解位點(diǎn)(112GRQGRL117)，同時(shí)

4、將L蛋白第Ⅵ結(jié)構(gòu)域中第1954位氨基酸由谷氨酸(E)突變成谷氨酰胺(Q)，成功構(gòu)建NDV突變株MG7的全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒pBSK-MG7并拯救出突變的基因Ⅶ型NDV MG7株，對(duì)拯救獲得的MG7株與親本強(qiáng)毒G7株在毒力、遺傳穩(wěn)定性和生長(zhǎng)特性等生物學(xué)活性進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示:MG7株(MDT＞120h;ICPI=0.20;IVPI=0)與親本G7株的毒力相比明顯減弱;MG7株病毒在雞胚上傳至15代時(shí)，突變位點(diǎn)能夠穩(wěn)定遺傳;弱毒MG7株在BHK

5、-21F細(xì)胞上的生長(zhǎng)曲線與親本G7株相似。結(jié)果表明，成功拯救出基因Ⅶ型NDV MG7株，MG7株具有NDV弱毒株的生物學(xué)特性。
　　2.基因Ⅶ型NDV減毒株MG7免疫SPF雞的效果研究
　　以成功拯救的基因Ⅶ型NDV減毒MG7株和商品化弱毒LaSota株作為疫苗，通過免疫SPF雞評(píng)價(jià)其免疫效果。通過滴鼻點(diǎn)眼接種4周齡SPF雞后，檢測(cè)血清中NDV特異性抗體滴度、血清中IFN-γ含量、雞外周血淋巴細(xì)胞中CD4+和CD8+T細(xì)胞亞

6、群變化以及淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng);采用NDV基因Ⅶ型強(qiáng)毒G7株攻擊免疫后的雞，測(cè)定其免疫保護(hù)效率。結(jié)果顯示:MG7株免疫3周后，能夠誘導(dǎo)SPF雞血清中產(chǎn)生NDV特異性抗體，且抗體水平(＞26.08)高于LaSota株免疫組(252)。MG7株免疫1～3周內(nèi)，外周血淋巴細(xì)胞(PBMCs)中CD8α+T淋巴細(xì)胞亞群比例呈逐漸上升趨勢(shì);MG7株免疫后第3周，PBMCs中CD4+T淋巴細(xì)胞亞群的比例明顯增加(p＜0.05）;MG7株免疫后PBMCs在

7、體外增殖活性明顯增強(qiáng)，第2周增強(qiáng)最大(p＜0.01）;同時(shí)，MG7株免疫組的血清中IFN-γ含量也呈遞增趨勢(shì)，與空白對(duì)照組存在極顯著差異(p＜0.01)。此外，以基因Ⅶ型NDV強(qiáng)毒株進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，在攻毒后第2～6d，MG7株免疫組SPF雞未檢測(cè)出排毒;LaSota株免疫組檢測(cè)到不同程度排毒現(xiàn)象，而空白對(duì)照組全部死亡。結(jié)果表明，與LaSota株免疫組相比，MG7株能夠有效誘導(dǎo)雞產(chǎn)生較高的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，提高SPF雞的保護(hù)效率和