坦布蘇病毒MM1775株反向遺傳操作系統(tǒng)的建立及拯救病毒的生物學(xué)特性研究.pdf

1、自2010年鴨坦布蘇病毒病在我國首次爆發(fā)以來，該病給我國鴨養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病主要表現(xiàn)為產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋率驟降，并伴有高熱、食欲下降、運(yùn)動(dòng)障礙等臨床癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致鴨死亡。第一株坦布蘇病毒分離株(MM1775株)，是從馬來西亞地區(qū)的蚊子體內(nèi)分離到的。在隨后幾十年陸續(xù)從蚊子體內(nèi)分離到很多株坦布蘇病毒，但卻很少有動(dòng)物感染該病毒的報(bào)道。到目前為止，早期坦布蘇病毒蚊體分離株在不同動(dòng)物體內(nèi)的復(fù)制能力、對動(dòng)物的致病性及在動(dòng)物間的傳播能力等生

2、物學(xué)特性尚不可知。了解坦布蘇病毒早期分離株與我國現(xiàn)在流行的鴨坦布蘇病毒株的生物學(xué)特性的差異，對研究坦布蘇病毒的致病機(jī)制具有重要意義。
　　為了比較MM1775和FX2010這兩株病毒基因組序列的差異，本研究測定了MM1775完整的基因組序列。通過5'和3' RACE技術(shù)擴(kuò)增得到MM1775基因組5'和3'末端的序列。利用RT-PCR擴(kuò)增得到10段兩兩重疊的涵蓋MM1775全基因組的目的片段，序列拼接后得到了MM1775全基因組序列

3、。與FX2010的全基因組序列相比，編碼蛋白(C、prM、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、 NS4A、NS4B和NS5)依次有5、4、16、21、16、4、8、4、5和18個(gè)氨基酸殘基不同。這些位點(diǎn)的差異可能決定了兩株病毒致病性的差異。使用PCR、克隆和亞克隆等方法將覆蓋MM1775基因組全長的3段cDNA插入到克隆載體獲得了3個(gè)重組質(zhì)粒。以上述3個(gè)重組質(zhì)粒為模板，利用融合PCR方法擴(kuò)增得到含有T7啟動(dòng)子的病毒全長cDNA，經(jīng)體

4、外轉(zhuǎn)錄得到感染性的RNA，將RNA轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞后48小時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞病變，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到90％，將細(xì)胞上清接種DF-1細(xì)胞72小時(shí)后，間接免疫熒光試驗(yàn)檢測顯示接種細(xì)胞有特異性的熒光，RT-PCR可以擴(kuò)增到特異性條帶。經(jīng)序列測定，拯救病毒的全基因組序列與親本病毒完全一致，表明成功構(gòu)建了MM1775反向遺傳操作系統(tǒng)。本研究比較了坦布蘇病毒MM1775拯救毒株(R-MM1775)和2010年在我國分離到的鴨坦布蘇病毒FX2010株在雞胚、小鼠

5、和鴨體內(nèi)的復(fù)制能力和致病性。結(jié)果表明，R-MM1775和FX2010對雞胚的致病性相似，經(jīng)尿囊腔接種9日齡雞胚后可以引起雞胚死亡，死亡后的雞胚呈現(xiàn)胚體嚴(yán)重水腫、充血和出血癥狀。105.0TCID50的R-MM1775滴鼻感染小鼠可引起小鼠嚴(yán)重的體重下降并最終死亡，感染后第4天，在小鼠肺和腦組織中可檢測到高滴度病毒;而同等劑量的FX2010滴鼻接種小鼠后，沒有引起小鼠體重變化，對小鼠也不致死，感染后第4天，在小鼠腦組織中沒有分離到病毒。1

6、03.5TCID50的R-MM1775肌肉注射接種鴨后，接種后第4天，接種鴨的脾臟中可檢測到高滴度的病毒，在肝、卵巢中檢測到較低滴度的病毒，其他臟器未檢測到病毒;而同等劑量的FX2010肌肉注射接種鴨的各主要臟器中均可檢測到較高滴度的病毒，接種鴨呈現(xiàn)全身性感染。103.5TCID50的R-MM1775鼻腔接種鴨后，接種后第4天，只有部分鴨體內(nèi)檢測到了病毒，而相同劑量的FX2010經(jīng)鼻腔接種后，所有接種鴨的主要臟器中均可檢測到較高滴度的病