應用新城疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)—構建L表達質粒.pdf

1、反向遺傳操作系統(tǒng)(reverse genetic system，RGS)就是獲得病毒的基因組序列后，借助于載體構建病毒的全長cDNA分子克隆，同時將RNA聚合酶的啟動子元件導入到此分子克隆中，經體外轉錄合成病毒RNA，進一步去侵染宿主或敏感細胞系，增殖出大量的與原病毒相似的活病毒，與之相關的研究技術稱為反向遺傳學技術(Reverse genetics manipulation technique)，也被稱為病毒拯救(Rescueof v

2、irus)。該技術為研究病毒蛋白功能、基因作用元件提供了方法，也使負鏈RNA病毒可作為載體表達外源基因。
　　 新城疫是由新城疫病毒引起的禽類急性傳染病。新城疫病毒(Newcastledisease virus，NDV)屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)新城疫樣病毒屬(Avulavirus)。新城疫病毒是不節(jié)段的負鏈RNA動物病毒，按其致病性的強弱新城疫病毒可分為三類：高致病性(強毒株)、中致病性(中毒株)和低致病

3、性(弱毒株)。NDV LaSota株屬于低致病性的弱毒株，多用作保護禽類的活疫苗。將NDV LaSota作為疫苗載體，有許多優(yōu)勢，如：可穩(wěn)定表達外源基因，其與同源的RNA病毒不發(fā)生重組；安全穩(wěn)定，成本低廉；弱毒株對人和動物無致病性；免疫接種途徑簡單；能夠誘導機體產生良好的體液免疫、黏膜免疫及局部免疫等。將NDV LaSota作為疫苗載體有很大的應用前景，因而引起研究者更多的關注。
　　 構建含有新城疫病毒全基因組的cDNA分子克

4、隆和含有RNA復制酶及核蛋白的編碼序列的輔助質粒，共同轉染宿主細胞，從而建立新城疫病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)，從而實現(xiàn)新城疫病毒的拯救。在新城疫病毒基因組編碼的六種蛋白中，L蛋白是病毒RNA聚合酶，與P蛋白形成具有完整聚合酶活性的復合物。P蛋白、NP蛋白和L蛋白與病毒基因組結合形成核糖核蛋白復合體(ribonucleoproteincomplex，RNP)是啟動NDV的復制、轉錄和翻譯所必需的。所以構建編碼L蛋白的基因的表達質粒是建立NDV

5、反向遺傳操作系統(tǒng)的基礎。
　　 本試驗通過在vero細胞中增殖病毒，用Trizol提取病毒RNA，應用長鏈RT-PCR法一次性擴增出約6.6kb的L基因，進一步將其與T-vecter相連亞克隆后，再與真核表達載體pcDNA3.1(+)相連，從而構建編碼L蛋白的基因的表達質粒。經RT-PCR、免疫組化檢測和限制性內切酶酶切鑒定以及基因測序認定L基因在BHK細胞中成功表達，L質粒構建成功。本研究為建立NDV的反向遺傳操作系統(tǒng)奠定了基