非洲豬瘟病毒P72基因單克隆抗體的制備及其重組桿狀病毒的構建.pdf

1、非洲豬瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African Swine FeverVirus，ASFV)引起的豬的一種急性、烈性傳染病。臨床上以高熱、全身性出血和高死亡率為特征。該病對養(yǎng)豬業(yè)危害巨大，被OIE列為A類疫病。盡管我國尚無該病的傳入，卻時刻面臨傳入的風險。因此，開展該病診斷方法和疫苗的儲備性研究，對于該病的防范具有重要意義。
　　 本研究利用原核表達的ASFV P72蛋白作為免疫原，制

2、備了P72蛋白的單克隆抗體，并構建了P72基因的重組桿狀病毒，為非洲豬瘟的診斷方法和免疫預防等研究奠定了基礎。
　　 具體研究內容如下：
　　 1.P72基因的原核表達及其單克隆抗體的制備
　　 根據(jù)已發(fā)表的序列，設計合成了ASFV P72基因，并將其克隆至原核表達載體pGEX-KG，得到重組原核表達質粒pKG-P72。將該質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導后，SDS-PAGE檢測證實，P72蛋白

3、以可溶性形式在大腸桿菌中獲得了高效表達。以純化的P72蛋白作為免疫原，免疫BALB/c小鼠，并通過細胞融合和間接ELISA方法篩選，獲得了5株能穩(wěn)定分泌針對P72蛋白的特異性單抗的雜交瘤細胞株，分別命名為1E1、1F3、3F1、3D11、4F10，單抗亞類鑒定均屬于IgG2a。經(jīng)間接免疫熒光和Western Blot分析，獲得的5株單克隆抗體均能與P72原核和真核表達蛋白發(fā)生特異性反應。
　　 2.P72基因重組桿狀病毒的構建<

4、br>　　 在構建真核表達質粒pcDNA-P72的基礎上，用BglⅡ+XbaⅠ雙酶切該質粒，獲得CMV-P72表達框，并將其插入到轉移載體pFast-VSV-G中，得到重組轉移質粒pFast-G-P72。將該轉移質粒轉化DH10Bac大腸桿菌感受態(tài)，通過藍白斑篩選得到陽性重組穿梭載體Bacmid-G-P72。將提取的重組Bacmid-G-P72 DNA轉染sf9昆蟲細胞，獲得重組桿狀病毒BV-G-P72。將重組桿狀病毒轉導EPC細胞，