豬腸三葉肽TFF3基因的克隆與原核表達(dá).pdf

1、腸三葉肽TFF3是三葉肽家族中最重要的小分子多肽，又稱為腸三葉因子(ITF)，主要分布于腸道。它由59個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，分子量約6.7KDa，屬于三葉肽家族，由于具有特殊的“三葉草”空間結(jié)構(gòu)，不僅能促進(jìn)腸黏膜細(xì)胞的增殖，還能與腸粘液中的糖蛋白發(fā)生結(jié)合，起到穩(wěn)定腸粘液和維護(hù)腸粘液屏障的作用，因而其在腸道損害修復(fù)以及再生方面具有非常重要的意義。因此，它是一種具有重要的潛在藥用價(jià)值的小蛋白分子，所以對腸三葉肽的研究并能加以有效地利用就有非常重

2、大的意義，并為深入研究TFF3的生理和藥理作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。目前多采用基因工程的方法獲取TFF3基因片段。有研究表明，半乳糖凝集素家族的成員之一，人類galectin-1，可以作為一個(gè)融合的合作伙伴在大腸桿菌生產(chǎn)可溶性腸三葉肽。因此，在本試驗(yàn)中，重新設(shè)計(jì)與構(gòu)建表達(dá)載體pET-28a，然后插入目的基因ITF，構(gòu)建新的表達(dá)質(zhì)粒pET28a-TFF3。再經(jīng)酶切插入原TFF3編碼序列，構(gòu)建pET28a—TFF3重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(D

3、E3) pLysS，異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。用SDS-PAGE和Western blot檢測表達(dá)蛋白。再用Tev酶切得到腸三葉肽TFF3。結(jié)果表明:
　　1.豬ITF基因的克隆提取豬腸道m(xù)RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出IFT基因，其唯長度為180bp，編碼由59個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其分子質(zhì)量約為6.49 kDa。
　　2.改造和構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET28a-TFF3表達(dá)質(zhì)粒改造自

4、pET-28a質(zhì)粒，在其中插入擴(kuò)增出galectin-1基因片段，然后在其后其后連上Tev蛋白酶酶切位點(diǎn)、6×His標(biāo)簽、多克隆位點(diǎn)，目的基因插入在多克隆位點(diǎn)中。至此重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-TFF3構(gòu)建結(jié)束。
　　3.將重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-ITF轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株BL21(DE3) pLysS，誘導(dǎo)表達(dá)。將獲得的重組質(zhì)粒pET28a-ITF轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3) pLysS感受態(tài)細(xì)胞，分別用不同終濃度的IPTG和不同

5、的誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間進(jìn)行誘導(dǎo)，以確定蛋白表達(dá)的最佳條件。在最佳誘導(dǎo)條件下經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳檢測，表達(dá)的融合蛋白分子量約為25 kDa，且主要可溶形式存在。以鼠抗6×His標(biāo)簽單克隆抗體和HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗對純化產(chǎn)物進(jìn)行免疫印跡檢測，結(jié)果在目的條帶所處位置出現(xiàn)一條印跡，且分子量大小與目的蛋白的相同，證實(shí)該蛋白為所需要的目的蛋白ITF。
　　4.豬ITF重組蛋白的純化。將獲得的蛋白樣品用His60 Ni重力柱