豬Sirtuin家族基因的克隆及脂肪生成中SIRT3的功能研究.pdf

1、哺乳動物的Sirtuin因子是酵母SIR2的同源蛋白質(zhì)家族，包含SIRT1-SIRT7共7個。這7個因子在機體的生長、發(fā)育、衰老以及代謝等方面具有重要的調(diào)節(jié)作用，是當今能量與物質(zhì)代謝，癌癥發(fā)生，長壽與衰老等研究領(lǐng)域的熱點。當前有關(guān)Sirtuin的研究主要集中在少數(shù)模式生物和人類，豬作為人類重要的肉食來源和典型的脂肪沉積動物，有關(guān)豬Sirtuin家族基因及其與脂肪代謝相關(guān)功能的研究對闡明生物中脂肪沉積的機理以及疾病防治具有重要意義。

2、>　　肥胖是二型糖尿病、動脈粥樣硬化等疾病的誘因之一，伴隨著人類物質(zhì)生活水平的提高而呈現(xiàn)高發(fā)趨勢，這類疾病的防治與治療也是當前生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。新生脂肪細胞的分化與脂肪的沉積是導(dǎo)致肥胖的主要原因，脂肪細胞的發(fā)育分化過程也伴隨著線粒體的生成、分裂、融合以及清除，線粒體介導(dǎo)的物質(zhì)代謝為脂肪細胞分化和脂肪沉積提供必需的能量，代謝產(chǎn)生ROS又可介導(dǎo)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與細胞生長、發(fā)育、分化、物質(zhì)代謝和應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控。
　　SIRT

3、3是Sirtuin家族中主要定位在線粒體中且是線粒體內(nèi)的主效去乙酰化酶，其通過調(diào)控線粒體內(nèi)的各種蛋白質(zhì)的乙?；揎棧{(diào)控線粒體的生長、發(fā)育和新陳代謝過程。不同剪接體的SIRT3也可以定位于細胞核內(nèi)，通過對Histone4，Ku70，F(xiàn)OXO3a等因子的去乙?；{(diào)控，參與細胞對ROS等脅迫反應(yīng)的調(diào)控。
　　本研究分離和鑒定了豬Sirtuin家族7個基因，對比分析了Sirtuin家族中7個因子的結(jié)構(gòu)和功能特征，用輻射雜種板技術(shù)和序列比

4、對將SIRT1-7定位在豬的相應(yīng)染色體區(qū)段，選取代表性物種的Sirtuin蛋白進行了分子進化樹的分析。以3T3L1細胞成脂分化為模型，研究了SIRT3在脂肪細胞分化過程中對線粒體清除的調(diào)控作用，全文得到以下結(jié)果:
　　1.通過同源序列法克隆了豬Sirtuin家族7個基因的全長cDNA序列。豬Sirtuin家族7個因子的開放式閱讀框的大小在1371bp到4064bp之間，分別編碼258到742個氨基酸不等。豬的Sirtuin家族因子

5、的編碼區(qū)與其它脊椎動物的同源蛋白具有83％-92％的相似性，預(yù)測的氨基酸序列與酵母的SIR2蛋白也保有38％-56％的同一性，酶活性域的同一性在高等哺乳動物間可達90％。
　　2.通過基因組PCR和可利用的豬DNA數(shù)據(jù)，獲得并分析豬SIRT1的基因及啟動子區(qū)。通過輻射雜種板技術(shù)和可利用的豬基因組信息，將豬的Sirtuin家族7個基因分別定位在14q23，6q11-12，2q29，14q19，7p12，2q11，12p15上，各個基

6、因在染色體上的位置與人Sirtuin基因在染色體上的位置相似。利用已有的豬基因組DNA數(shù)據(jù)和基因組PCR，獲得了豬SIRT6的兩個剪接突變體和基因組結(jié)構(gòu)，并與人SIRT6的潛在突變體進行了比較分析。
　　3.實時定量PCR檢測了SIRT1-7以及SIRT6的兩個剪接突變體在16個組織樣本中的表達水平，7個基因在所有的組織中均有表達，在神經(jīng)系統(tǒng)和睪丸的表達量為最高。
　　4.首次利用29個代表性物種共93條非冗余SIR2家族因

7、子氨基酸序列，進行了Sirtuin的進化分析。系統(tǒng)進化樹樹型顯示Sirtuin家族因子可以分成兩個亞族，亞族又可以進一步分為SIRT1/2/3，SIRT4，SIRT5，SIRT6/7等亞群。
　　5.脂肪細胞分化初期伴隨著線粒體的大量生成，而在分化后期線粒體數(shù)量顯著減少。DHE染色顯示成脂分化期間ROS的濃度也存在先上升后下降的趨勢，且峰值滯后于線粒體數(shù)量峰值出現(xiàn)。
　　6.克隆了小鼠SIRT3啟動子，生物信息學(xué)預(yù)測其中存在

8、典型的PPAR-γ結(jié)合位點。雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析，PPAR-γ激動劑和抑制劑處理，RNAi以及基因共表達證實SIRT3受PPAR-γ的正調(diào)控，ChIP證實PPAR-γ主要通過結(jié)合SIRT3啟動子區(qū)域中-3771/-3610位點來調(diào)控SIRT3的表達。
　　7.脂肪細胞分化過程中，伴隨著SIRT3和Beclin-1等基因的上調(diào)表達，二者的時空表達模式與PPAR-γ極為相似，且干擾PPAR-γ的表達，SIRT3和Beclin-1的表