花生中SOS基因家族的克隆及抗逆性分析.pdf

1、花生是世界上分布最廣、種植面積最大的油料作物，種植總面積和總產(chǎn)量均為各種作物之首。土壤鹽漬化嚴(yán)重影響了農(nóng)作物的產(chǎn)量和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，對(duì)植物尤其是農(nóng)作物進(jìn)行耐鹽、耐旱的改良勢(shì)在必行。傳統(tǒng)的遺傳育種難以打破種間隔離的限制，而借助于基因工程技術(shù)，通過轉(zhuǎn)基因可解決這一問題。已知SOS基因家族及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在植物抗鹽及耐鹽過程中具有重要作用。本研究從花生(Arachis hypogaea L.)中成功克隆到SOS基因家族成員，包括AhSOS2和

2、AhSOS3全長(zhǎng)基因序列，及AhSOS1部分基因片段，并對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行分析，在此基礎(chǔ)上對(duì)部分基因的功能及抗鹽能力通過離體測(cè)定結(jié)合轉(zhuǎn)基因水稻抗鹽性分析進(jìn)行了初步研究。本論文是對(duì)花生中SOS基因家族及其生物學(xué)功能的首次報(bào)道。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)花生中SOS基因家族成員的分離及表達(dá)特性分析
　　本研究以花生“魯花14”為實(shí)驗(yàn)材料，結(jié)合RACE的方法，從花生葉片中分離到SOS基因家族成員分別屬于SOS1、SOS2和SOS

3、3基因，被命名為AhSOS1、AhSOS2(GenBank登錄號(hào):HG797656)和AhSOS3(GenBank登錄號(hào):HG977144)基因。其中AhSOS2基因長(zhǎng)為1462 bp、包含1341 bp開放閱讀框(ORF)的cDNA片段，編碼446個(gè)氨基酸，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。AhSOS3基因包括651 bp的開放閱讀框，編碼216個(gè)氨基酸，屬于Ca2+結(jié)合蛋白，鑒于花生中AhSOS1基因序列較長(zhǎng)，且針對(duì)該基因的預(yù)測(cè)信息存在一

4、定誤差，故只獲得該基因的部分片段。對(duì)SOS基因家族中基因表達(dá)模式的熒光定量PCR分析顯示，AhSOS1、AhSOS2和AhSOS3基因在花生中均為組成型表達(dá)，且經(jīng)250 mmol L-1 NaCl和30％ PEG-6000模擬干旱處理后， AhSOS1、AhSOS2和AhSOS3基因在花生的根、莖、葉中表達(dá)量均有不同程度的上調(diào)。顯示SOS基因家族成員表達(dá)受鹽脅迫及干旱誘導(dǎo)，推測(cè)該家族成員在花生抗鹽、抗旱及其他抗逆過程中可能具有一定作用。

5、
　　(2)花生AhSOS2和AhSOS3基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白表達(dá)
　　以花生AhSOS2基因和AhSOS3基因cDNA序列為模板，經(jīng)PCR獲得AhSOS2和AhSOS3基因的蛋白編碼區(qū)，分別將該區(qū)段與表達(dá)載體pET-28a(+)融合，構(gòu)建獲得原核表達(dá)載體pET-28a-AhSOS2和pET-28a-AhSOS3，并進(jìn)一步在大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)中進(jìn)行表達(dá)。經(jīng)1.0 mmol L-1IPTG誘導(dǎo)后，SDS-

6、PAGE電泳顯示AhSOS2基因編碼一條約51 kDa的融合蛋白條帶，而AhSOS3基因編碼一條約25 kDa的融合蛋白條帶。且基因的蛋白表達(dá)產(chǎn)物在25℃下，隨著IPTG誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而表達(dá)量逐漸提高，經(jīng)誘導(dǎo)6h和8h后均可獲得較高的蛋白表達(dá)水平。以上結(jié)果顯示，AhSOS2基因和AhSOS3基因可在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，且隨誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，所表達(dá)的蛋白量有所提高。該結(jié)果為進(jìn)一步在蛋白水平上研究基因的特性及功能奠定了基礎(chǔ)。
　　(

7、3)花生AhSOS2和AhSOS3基因功能的體外及體內(nèi)驗(yàn)證
　　離體條件下，通過對(duì)AhSOS2基因在不同鹽濃度平板上的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)及菌液培養(yǎng)中原核菌株中的生長(zhǎng)曲線測(cè)定，結(jié)果顯示，在250 mmolL-1高鹽脅迫下，含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌比含有空載體的菌株生長(zhǎng)速度快，經(jīng)培養(yǎng)12 h后，AhSOS2基因菌液生長(zhǎng)狀態(tài)及菌液濃度均好于儀含有空載體的菌株的菌液，而含有AhSOS3基因的菌株的生長(zhǎng)及菌液濃度也好于僅含有空載體的菌株，且在菌株培養(yǎng)1

8、8h后差別最明顯，顯示轉(zhuǎn)入SOS家族相關(guān)基因后，菌株具有了一定的抗鹽功能。
　　同時(shí)，通過構(gòu)建AhSOS2和AhSOS3基因的植物雙元表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化水稻，以轉(zhuǎn)基因水稻為材料對(duì)基因的生理功能及抗性進(jìn)行了初步研究。目前，已獲得AhSOS2轉(zhuǎn)基因陽性株系20個(gè)，AhSOS3轉(zhuǎn)基因陽性株系40個(gè)。對(duì)AhSOS2轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照植株進(jìn)行NaCl處理后、葉中的Na+、K+含量測(cè)定結(jié)果顯示,隨著處理濃度的提高，對(duì)照與轉(zhuǎn)基因植株中Na+含量逐漸上