SIRT3在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)及其抑瘤作用的研究.pdf

1、原發(fā)性肝細(xì)胞癌是全世界最常見惡性腫瘤之一,其死亡率在惡性腫瘤中位于胃癌、食道癌之后居第三位。我國是原發(fā)性肝細(xì)胞癌的高發(fā)區(qū),我國每年死于肝癌的人數(shù),約占全世界肝癌死亡人數(shù)的50％。近20年來,雖我國的肝癌治療水平取得了長足的進(jìn)步,但肝癌的發(fā)病率和死亡率仍位于癌癥中第二位。
　　SIRT3是沉默信息調(diào)節(jié)因子家族(Sirtuins,silent information regulator)中一員,線粒體內(nèi)主要的去乙酰化酶,近年新發(fā)現(xiàn)的一

2、種抑癌基因,但當(dāng)前,對于SIRT3在肝癌發(fā)病過程中發(fā)揮的作用尚無相關(guān)研究報(bào)道。因此,進(jìn)一步研究揭示SIRT3在肝癌中的作用和功能,為肝癌診斷及治療提供依據(jù)有著十分重要的意義。
　　本研究分為三部分:
　　第一章SIRT3在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義
　　目的：
　　觀察SIFRT3在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá),并分析其在肝癌中表達(dá)的意義。
　　方法：
　　采用免疫組織化學(xué)和Westem-blotti

3、ng實(shí)驗(yàn)方法檢測在32例原發(fā)性肝細(xì)胞癌的癌和癌旁組織及10例正常肝組織中表達(dá)情況,并分析及意義。
　　結(jié)果：
　　1、免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果在32例肝癌石蠟組織標(biāo)本中,共有19例呈陽性表達(dá),但無強(qiáng)陽性表達(dá),SIRT3的陽性表達(dá)率為59.38％(19/32);癌旁肝硬化組織中共例31阻性表達(dá),SIRT3的陽性表達(dá)率為96.88％(31/32),其中18例呈強(qiáng)陽性表達(dá);而10例正常肝組織中全部呈陽性表達(dá),其陽性表達(dá)率為100.0％(1

4、0/10),并有7例呈強(qiáng)陽性表達(dá)。肝癌組織與癌旁肝硬化、正常肝組織相比較,SIRT3陽性表達(dá)率及陽性評分均數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而癌旁組織與正常肝組織之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2、Western-blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果在32例肝癌組織中SIRT3蛋白的表達(dá)量(SIRT3/GAPDH)明顯低于癌旁肝硬化組織的蛋白表達(dá)量及正常肝組織的蛋白表達(dá)量,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。雖然癌旁組織中的

5、SIRT3蛋白表達(dá)水平略低于正常肝組織,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3、肝癌組織中SIRT3蛋白表達(dá)量與臨床病例資料的關(guān)系結(jié)果32例肝癌組織中SIRT3的表達(dá)水平與性別、年齡、AFP值、腫瘤大小及有無包膜之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與門靜脈癌栓、腫瘤細(xì)胞的分化程度之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　在正常肝組織、肝癌癌旁組織中SIRT3呈高表達(dá);在肝癌組織中SIRT3

6、呈低表達(dá)或缺失提示在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了一定的作用。
　　第二章SIRT3基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
　　目的：
　　構(gòu)建SIRT3真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞株,確定下步試驗(yàn)的最佳時(shí)間點(diǎn)。
　　方法：
　　以臨床獲取的正常肝組織mR NA為模板,通過RT-PCR方法獲得SIRT3基因全長序列,將其克隆連接pZsGreen-c1載體,進(jìn)行序列、雙酶切鑒定。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至肝癌H

7、epG2細(xì)胞株中。將細(xì)胞株分為三組:pZsGreen-c1-SIRT3 HepG-2組(實(shí)驗(yàn)組)、pZsGreen-c1 HepG2組(實(shí)驗(yàn)對照組)和HepG2N胞(空白對照組),通過Western-blotting試驗(yàn)方法檢測轉(zhuǎn)染0h、24h、48h、72h、96h后,各組細(xì)胞中SIRT3的表達(dá)情況,并確定下一步最佳實(shí)驗(yàn)時(shí)間。
　　結(jié)果：
　　成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pZsGreen-c1-SIRT3,并將其轉(zhuǎn)染至HepG2

8、細(xì)胞株。Westem-blotting檢測結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染48h后pZsGreen-c1-SIRT3 HepG2細(xì)胞株中SIRT3蛋白的表達(dá)水平明顯高于pZsGreen-c1HepG2組和HepG2組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),轉(zhuǎn)染后72小時(shí)為下一步實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建pZsGreen-c1-SIRT3的真核表達(dá)質(zhì)粒并鑒定。
　　第三章SIRT3抑制HepG2作用的初步研究
　　目的

9、：
　　觀察pZsGreen-c1-SIRT3 HepG2細(xì)胞株的增殖和調(diào)亡,并研究其初步作用機(jī)制。
　　方法：
　　采用RT-PCR、Western-blotting實(shí)驗(yàn)方法檢測HepG2、LO2細(xì)胞株的SIRT3 mRNA及蛋白的表達(dá)水平的表達(dá);采用MTT實(shí)驗(yàn)觀察pZsGreen-c1-SIRT3 HepG2、pZsGreen-c1 HepG2和HepG2三組細(xì)胞株的生長、增殖;AnnexinV/PI雙標(biāo)測三組細(xì)胞

10、株的凋亡率。采用RT-PCR和Western-blotting實(shí)驗(yàn)方法檢測pZsGreen-c1-SIRT3 HepG2細(xì)胞株、pZsGreen-c1 HepG2細(xì)胞株和HepG2細(xì)胞株中SIRT3、Fas、Bax、P53 mRNA及蛋白的表達(dá)水平和WST-1方法檢測三組細(xì)胞株中MnSOD含量。
　　結(jié)果：
　　1、RT-PCR和Western-blotting實(shí)驗(yàn)LO2細(xì)胞株中SIRT3表迭量較HepG2細(xì)胞株的表達(dá)水平明

11、顯增高,兩組細(xì)胞株比較之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2、MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果pZsGreen-c1-SIRT3 HepG2、pZsGreen-c1HepG2和HepG2三組細(xì)胞株的OD值隨培養(yǎng)時(shí)間延長,OD值逐漸升高,呈時(shí)間依賴性,C組與A、B組細(xì)胞株培養(yǎng)48小時(shí)后不同時(shí)間點(diǎn)OD值、抑制率之間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。三組細(xì)株培養(yǎng)48小時(shí)候不同時(shí)間點(diǎn)的OD值及抑制率之間比較的結(jié)果提示pZsGreen-c1

12、HepG2細(xì)胞株生長受到了明顯的抑制,且pZsGreen-c1-SIRT3 HepG2細(xì)胞株培養(yǎng)48小時(shí)后的抑制率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長,而抑制率升高,呈時(shí)間依賴性。
　　3、AnnexinV/PI雙標(biāo)測三組細(xì)胞株凋亡率比較:pZsGreen-c1-SIRT3 HepG2細(xì)胞組早期和晚期凋亡細(xì)胞期細(xì)胞,相對于pZsGreen-c1 HepG2和HepG2兩組細(xì)胞株都明顯增多,具有顯著性差異(P＜0.01)。
　　4、RT-PCR

13、an Western-blotting實(shí)驗(yàn)pZsGreen-c1 HepG2和HepG2兩組細(xì)胞株中SIRT3、p53、Bax、Fas表達(dá)量二者之間無顯著性差異( P＞0.05),pZsGreen-c1-SIRT3 HepG2細(xì)胞組中SIRT3、p53、Bax、Fas表達(dá)水平明顯增加,它們的表達(dá)水平與pZsGreen-c1 HepG2和HepG2兩組細(xì)胞株比較之間顯著性差異(P＜0.01)。
　　5、WST-1法檢測了三組細(xì)胞株中

14、MnSOD的含量,其中pZsGreen-c1 HepG2和HepG2兩組細(xì)胞株中MnSOD含量二者之間無顯著差異性(P＞0.01);pZsGreen-c1-SIRT3 HepG2細(xì)胞組中MnSOD的含量較其他組的含量明顯增加,與pZsGreen-ct HepG2和HepG2兩組細(xì)胞株比較之間有顯著性差異(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1、pZsGreen-c1-SIRT3具有抑制HepG2細(xì)胞株的生長增殖,誘導(dǎo)HepG2

15、細(xì)胞株的凋亡的作用;
　　2、其可能的作用機(jī)制是SIRT3高表達(dá)上調(diào)MnSOD和p53的表達(dá)水平,及MnSOD上調(diào)Bax、FaS來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　總結(jié)論：
　　1、在正常肝組織、肝癌癌旁組織中SIRT3呈高表達(dá),在肝癌組織中SIRT3呈低表達(dá)或缺失;提示SIRT3在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了一定的作用;
　　2、成功構(gòu)建pZsGreen-c1-SIRT3的真核表達(dá)質(zhì)粒并鑒定;
　　3、pZsGreen-