長穗偃麥草AP2-ERF家族轉(zhuǎn)錄因子的功能研究.pdf

1、AP2/ERF(乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白)轉(zhuǎn)錄因子家族是植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，主要參與植物的細(xì)胞周期、生長發(fā)育以及生物和非生物脅迫相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控。根據(jù)它們含AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域的數(shù)目，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子超家族分為AP2、RAV和ERF三個(gè)家族。ERF家族含有一個(gè)AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域，又分為CBF/DREB家族、ERF家族和其他蛋白。DREB屬于CBF/DREB亞族，是干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白，參與植物對(duì)干旱、高鹽、低溫、水澇

2、等非生物脅迫的應(yīng)答，調(diào)控逆境誘導(dǎo)基因的表達(dá)。ERF亞族基因參與植物對(duì)激素（乙烯）的分子應(yīng)答反應(yīng)，在非生物脅迫中也起作用。目前AP2家族基因研究最多的是模式植物擬楠芥，在抗逆性優(yōu)良的野生資源植物中還很少研究。因此，加快野生資源植物中的抗逆優(yōu)異基因資源的挖掘和功能驗(yàn)證對(duì)農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因育種具有重要應(yīng)用價(jià)值和理論意義。EeAP2.2和EeAP2-1.1基因是本實(shí)驗(yàn)室從抗逆性優(yōu)良的長穗偃麥草中克隆的2個(gè)AP2/ERF家族抗逆高豐度表達(dá)基因。本研究應(yīng)

3、用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)EeAP2.2和EeAP2-1.1的功能進(jìn)行了預(yù)測，通過半定量RT-PCR檢測了高鹽和干旱脅迫下二者基因轉(zhuǎn)錄豐度的變化，并通過轉(zhuǎn)化煙草對(duì)EeAP2.2的抗逆性功能進(jìn)行了初步研究，利用NMT技術(shù)表達(dá)EeAP2.2的抗逆性機(jī)理進(jìn)行了探討。同時(shí)構(gòu)建了pSB187-EeAP2.2:GFP融合表達(dá)載體，并對(duì)用于轉(zhuǎn)基因煙草篩選的潮霉素最適生長濃度進(jìn)行了摸索。得到如下研究結(jié)果:
　　 1.EeAP2.2和EeAP2-1.1基

4、因均含有一個(gè)保守的YRG和RAYD結(jié)構(gòu)域，屬于EREBP家族，EeAP2.2基因?qū)儆贓RF家族中的DREB亞族基因，EeAP2-1.1基因?qū)儆贓RF家族中的ERF亞族基因。
　　 2.在未脅迫條件下EeAP2-1.1在根部的表達(dá)量要明顯低于EeAP2.2，干旱和高鹽脅迫均能誘導(dǎo)二者的上調(diào)表達(dá)，脅迫4小時(shí)在根部和葉部二者的表達(dá)量均有顯著增加，脅迫12小時(shí)，二者在根部和葉部的表達(dá)量持續(xù)增加，但在PEG脅迫條件下的EeAP2-1.1基

5、因基本維持在脅迫4小時(shí)時(shí)的表達(dá)水平。
　　 3.EeAP2.2轉(zhuǎn)基因煙草干旱脅迫后增加K+內(nèi)流，高鹽脅迫阻止K+和H+大量外流，低溫脅迫后H+和K+流速和流向出現(xiàn)反常，但是脅迫后恢復(fù)正常培養(yǎng)時(shí)野生植株全部死亡。
　　 4.轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測結(jié)果顯示，EeAP2.2基因成功整合到了煙草基因組中。轉(zhuǎn)基因煙草植株在正常生長條件下出現(xiàn)矮化，平均株高降低約44％，葉片總數(shù)減少41.4％，單葉面積減小近38％，但是在開花期綠葉數(shù)增