兩種沼蝦溶菌酶基因的克隆與羅氏沼蝦溶菌酶基因的組織表達分析.pdf

1、近年來頻繁爆發(fā)的蝦類病害引起了人們對蝦類自身免疫機制的重視。目前普遍認(rèn)為蝦類和其它無脊椎動物一樣，體液中不具有免疫球蛋白，缺乏脊椎動物所具有的特異性免疫機制，主要依靠體內(nèi)的非特異性免疫因子抵抗外來病原的入侵。溶菌酶是生物體內(nèi)重要的非特異免疫因子之一，在引發(fā)和維持機體防御免疫的過程中起重要作用。本實驗克隆了羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）、日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)溶菌酶基因

2、cDNA，并以重組羅氏沼蝦溶菌酶Lyz-T質(zhì)粒作為模板，PCR法制備羅氏沼蝦溶菌酶基因的生物素標(biāo)記探針，用Northern Dot Blot方法檢測羅氏沼蝦正常和弧菌感染個體各組織中的溶菌酶基因的表達情況，初步評價其免疫防御功能，為進一步開展蝦類的免疫防御分子機制的研究奠定基礎(chǔ)。 1 兩種沼蝦溶菌酶基因ORF的克隆與序列分析 　本實驗參考多種生物類群的溶菌酶基因序列，設(shè)計并合成引物。分別提取羅氏沼蝦和日本沼蝦血細胞總RNA

3、。以此總RNA為模板，RT-PCR擴增獲得特異性cDNA片段，純化后克隆到T載體上。重組子序列測定表明，所克隆的2種沼蝦溶菌酶基因的開放閱讀框（ORF）均為477bp，編碼158個氨基酸，包括成熟肽140個氨基酸殘基和信號肽18個氨基酸殘基。同源性分析表明，所克隆的2種沼蝦溶菌酶的基因序列和推測氨基酸序列之間都具有較高同源性，分別為99.4％和98.1％；與已在GenBank上登錄的對蝦溶菌酶基因的同源性為80％以上。與人、雞、魚、按蚊

4、等不同生物類群的c-型溶菌酶的推測氨基酸序列同源性也高于30％。2種沼蝦溶菌酶都具有c-型溶菌酶保守的兩個酶活性位點谷氨酸殘基（Glu51）和天門冬氨酸殘基（Asp68），以及保守的8個半胱氨酸殘基（Cys），因而推測所克隆的2種沼蝦溶菌酶基因?qū)賑-型溶菌酶基因。同時，由于所克隆的2種沼蝦溶菌酶缺少c-型溶菌酶的鈣結(jié)合亞型所特有的3 個保守的天門冬氨酸殘基（Asp），可認(rèn)為這兩種沼蝦溶菌酶基因?qū)儆赾-型溶菌酶的非鈣結(jié)合亞型。 2

5、 羅氏沼蝦溶菌酶基因的組織表達分析 2．1 羅氏沼蝦溶菌酶基因正常個體的組織分布 用PCR法制備了生物素標(biāo)記的內(nèi)參照18S rRNA基因探針和溶菌酶基因探針，并利用此探針與各組織總RNA樣品進行斑點雜交，結(jié)果顯示羅氏沼蝦溶菌酶基因在眼、肌肉、鰓、肝胰腺、血細胞、腸管等組織中均有表達，但表達量不同。其中在腸管中的表達量最高，肝胰腺次之，肌肉中的表達量最低。 2．2 羅氏沼蝦溶菌酶基因在感染個體不同組織中的表達

6、 斑點雜交檢測受弧菌感染的羅氏沼蝦個體溶菌酶基因在各組織中的表達，結(jié)果表明受感染后6h,在蝦的眼、肌肉、鰓、肝胰腺、腸管等組織中溶菌酶基因的表達量均有升高，其中以肝胰腺中的表達量最高，約為對照組的5.6倍。在血細胞中的表達量稍有降低。 2．3 羅氏沼蝦溶菌酶基因在肝胰腺中的表達隨感染時間的變化 在不同的感染時間里，肝胰腺中溶菌酶基因表達量有較大的變化：感染后3h表達量最低，6h后迅速升高，表達量約為對照組的4倍