抗凍蛋白基因的克隆及其在羅氏沼蝦中的整合.pdf

1、該研究的特色和創(chuàng)新之處在于,針對(duì)羅氏沼蝦不耐低溫,但體型相對(duì)較大,精莢明顯的特點(diǎn),首次將目前已知具有最強(qiáng)抗凍活性的云杉卷葉蛾(spruce budworm,Choristoneura fumiferana)抗凍蛋白(sbwAFP)基因(sbwAFP),通過(guò)精子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)整合到羅氏沼蝦的胚胎中,以期培育出耐低溫的羅氏沼蝦新品系.這不僅對(duì)羅氏沼蝦的遺傳育種工作是一個(gè)重大的突破,而且對(duì)帶動(dòng)和促進(jìn)其它蝦、蟹類等水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物轉(zhuǎn)基因育種工作的

2、開(kāi)展,改變中國(guó)目前的養(yǎng)殖結(jié)構(gòu),降低生產(chǎn)成本,促進(jìn)現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,提高經(jīng)濟(jì)效益,都具有重要的意義.該研究采用重疊序列延伸法獲得sbwAFP,經(jīng)PCR擴(kuò)增后,將其插入到質(zhì)粒載體pCMV-EGFP-SV40UTR中,置于細(xì)胞肥大病毒啟動(dòng)子(CMVp)和增強(qiáng)綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)cDNA(EGFP)之間,構(gòu)建了表達(dá)載體pCMV-sbwAFP-SV40UTR.通過(guò)精莢微注射

3、(spermatophoremicroinjection,SMI)——一種精子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入羅氏沼蝦,即將外源DNA直接注射入羅氏沼蝦的精莢.其后的受精及卵的孵化均在正常條件下完成.以sbwAFP首尾兩端的特異序列為引物,PCR分析SMI獲得的蝦胚胎的基因組DNA,有試樣可得一308bp的擴(kuò)增產(chǎn)物,與sbwAFP的大小相符,而僅注射PBS和未注射的陰性對(duì)照蝦胚胎沒(méi)有擴(kuò)增條帶,說(shuō)明SMI獲得的蝦胚胎基因組中確有sbwAFP的整合.從