羅氏沼蝦咽側體抑制素基因及其天然反義RNA的分子特征與表達分析.pdf

1、咽側體抑制素是無脊椎動物中最大的神經(jīng)肽家族之一，在昆蟲中它不僅可以抑制保幼激素的合成與釋放，還可以通過調節(jié)肌肉的收縮影響其它生理過程。然而在除昆蟲以外的其它任何物種中，均沒有編碼咽側體抑制素基因的報道，更沒有其基因表達時空特征以及相關調控因子的研究。 本研究以具有重要經(jīng)濟價值的淡水蝦類—羅氏沼蝦(Macrobrachimrosenbergii)作為研究對象，從其中樞神經(jīng)系統(tǒng)的cDNA文庫中分別克隆到羅氏沼蝦咽側體抑制素基因(命名

2、為Macro-ASTA)及其內(nèi)源性天然反義基因(命名為asMacro-ASTA)。Macro-ASTA全長為2,855bp，編碼一個由701個氨基酸殘基組成的咽側體抑制素前體多肽。如果所有的堿性蛋白酶切位點被識別剪切，那么這個前體多肽最少可以形成35個，29種不同類型的咽側體抑制素。asMacro-ASTA全長為2,182bp，包含的最大開放閱讀框僅由159bp組成。Blast分析發(fā)現(xiàn)沒有其它已知的基因或蛋白與asMacro-ASTA具

3、有同源性。但是，在其序列內(nèi)部(882bp到1,725bp)存在一段與Macro-ASTA基因3'末端完全反向互補的序列。這是首次在甲殼動物中發(fā)現(xiàn)編碼咽側體抑制素的基因，同時，也是在所有已發(fā)現(xiàn)的咽側體抑制素基因中首次檢測到它們存在天然反義基因。 另外，運用半定量RT-PCR和Southernblottinganalysis等分子生物學手段分析了Macro-ASTA在羅氏沼蝦體內(nèi)的分布情況和發(fā)育表達特征，以及在基因組上的拷貝數(shù)。結果

4、表明：Macro-ASTA在神經(jīng)組織如腦、胸部神經(jīng)節(jié)、腹部神經(jīng)節(jié)和內(nèi)分泌組織如腸中表達，而在其它組織如心臟、腮、卵巢、肝臟或肌肉組織中均不表達；雌性羅氏沼蝦從未成熟向成熟階段發(fā)育的過程中，不論是在胸部神經(jīng)節(jié)還是在腦組織中Macro-ASTA的表達量都呈現(xiàn)增加趨勢，但是在蛻皮后一天表達量下降，而且在腦組織中，這種增加與下降的趨勢更加明顯；在雄性羅氏沼蝦的附肢掌節(jié)從白色向黃色轉變的過程中，Macro-ASTA的表達量在胸部神經(jīng)節(jié)中呈上升趨勢

5、，在腦組織中呈下降趨勢；當雄蝦附肢掌節(jié)變藍時，Macro-ASTA的表達量在胸部神經(jīng)節(jié)中迅速下降，在腦組織中基本無表達；Macro-ASTA在羅氏沼蝦的基因組中以單拷貝形式存在。 最后，為了證明正義基因Macro-ASTA與其天然反義基因asMacro-ASTA之間是否存在相互作用，我們運用Northernblottinganalysis以及依賴于核糖核酸酶保護分析的RT-PCR等方法證明：asMacro-ASTA在羅氏沼蝦的胸

6、部神經(jīng)節(jié)中有表達，而Macro-ASTA也在此組織中表達；在胸部神經(jīng)節(jié)中，Macro-ASTA與asMacro-ASTA的轉錄本之間在互補區(qū)域形成了RNA-RNA二聚體。這些結果說明反義基因可能對咽側體抑制素基因的表達有著重要的調控作用。 總之，這是第一次在甲殼動物中分離到編碼咽側體抑制素的基因，并研究了其組織分布與表達特征。同時本研究也是第一次發(fā)現(xiàn)咽側體抑制素基因存在天然反義基因，更為重要的是，本研究還發(fā)現(xiàn)正義基因與反義基因的