中華絨螯蟹、羅氏沼蝦CyclinB基因cDNA克隆及其在卵子發(fā)生過(guò)程中表達(dá)分析.pdf

1、本論文通過(guò)基因表達(dá)分析探討了CyclinB在中華絨螯蟹和羅氏沼蝦卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟中的作用，對(duì)于了解蝦蟹類卵母細(xì)胞成熟分裂機(jī)制具有重要學(xué)術(shù)價(jià)值，同時(shí)也可為生產(chǎn)上人工控制卵子成熟提供參考。 Cyclin B結(jié)合催化亞基Cdc2激酶形成促細(xì)胞成熟因子(MPF)，從而參與調(diào)控了動(dòng)物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂。盡管Cyclin B的調(diào)控作用在很多種真核生物報(bào)道過(guò)，但是在甲殼動(dòng)物中報(bào)道很少。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用簡(jiǎn)并PCR和RACE方法第一次從中華絨螯蟹卵巢

2、中克隆了cyclin B cDNA全長(zhǎng)序列。該序列全長(zhǎng)3,794 bp,包含編碼410個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框和超長(zhǎng)的的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)(2.4kb)。超長(zhǎng)3’UTR存在潛在的翻譯正調(diào)控元件TCE和轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控元件K box(TGTGAT)。RT-PCR結(jié)果顯示，cyclin B mRNA僅分布在卵巢、精巢和心臟組織中。在卵巢不同發(fā)育時(shí)期存在分化表達(dá)，在卵黃發(fā)生前的未成熟卵巢中表達(dá)量最高，卵黃發(fā)生前期和中期表達(dá)較低，在卵黃發(fā)生末期

3、(lVt)和生發(fā)泡破裂(GBVD)期表達(dá)顯著上升，表明CyclinB在卵原細(xì)胞的有絲分裂和卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程有著緊密聯(lián)系。 蛻皮激素是一類所有節(jié)肢動(dòng)物所含有的一種類固醇激素。在果蠅中，蛻皮激素被證明能夠誘導(dǎo)昆蟲(chóng)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的重啟。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外注射的方法來(lái)探討蛻皮激素對(duì)羅氏沼蝦卵母細(xì)胞成熟分裂的誘導(dǎo)作用。每尾雌蝦注射蛻皮激素工作液(10ng/g)，直至全部蛻皮，對(duì)照組同時(shí)注射等量的1.2％的生理鹽水。自然成熟組不注射任何試

4、劑在同樣飼養(yǎng)條件下自然成熟。激素實(shí)驗(yàn)組羅氏沼蝦注射第一天開(kāi)始蛻皮并在7天內(nèi)全部蛻皮。自然成熟實(shí)驗(yàn)組第7天才有蝦蛻皮在14天內(nèi)全部蛻皮，而對(duì)照組在7天內(nèi)沒(méi)有發(fā)生蛻皮。進(jìn)一步通過(guò)組織細(xì)胞觀察發(fā)現(xiàn)激素實(shí)驗(yàn)組和自然成熟實(shí)驗(yàn)組生殖蛻皮10h后卵母細(xì)胞才完全進(jìn)入減數(shù)分裂中期，表明了體外注射蛻皮激素能夠提前誘導(dǎo)羅氏沼蝦生殖蛻皮從而使得卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂的重啟提前。 為了從分子水平來(lái)探討蛻皮激素對(duì)羅氏沼蝦卵母細(xì)胞減數(shù)分裂重啟的誘導(dǎo)作用，進(jìn)一步研

5、究了蛻皮激素對(duì)CyclinB基因表達(dá)的影響。首先，通過(guò)簡(jiǎn)并引物RT-PCR和RACE的方法克隆得到了羅氏沼蝦CyclinB的cDNA全長(zhǎng)。通過(guò)Real-timeRT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CyclinB mRNA在羅氏沼蝦卵母細(xì)胞最終成熟過(guò)程中存在著差異表達(dá)，表明了CyclinB基因與羅氏沼蝦減數(shù)分裂重啟有著緊密關(guān)系。蛻皮激素實(shí)驗(yàn)組CyclinB基因在蛻皮5h、10h和14h表達(dá)量顯著高于自然成熟組。同樣，與對(duì)照組相比，注射蛻皮激素能顯著增加

6、CyclinB基因的表達(dá)，表明了羅氏沼蝦卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，蛻皮激素能夠促進(jìn)CyclinB基因的表達(dá)，進(jìn)一步表明了蛻皮激素卵母細(xì)胞減數(shù)分裂重啟過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。 綜上，CyclinB基因在中華絨螯蟹和羅氏沼蝦卵子發(fā)生過(guò)程中存在分化表達(dá)，特別是在生發(fā)泡破裂時(shí)期有著很高的表達(dá)，表明了CyclinB與中華絨螯蟹和羅氏沼蝦卵母細(xì)胞減數(shù)分裂緊密相關(guān)。蛻皮激素能夠使羅氏沼蝦生殖蛻皮和生發(fā)泡破裂提前，并能夠促進(jìn)Cyclin B基因的表達(dá)，