轉(zhuǎn)基因克隆山羊的再克隆.pdf

1、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是目前生物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn).體細(xì)胞核移植技術(shù)在制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物方面有許多優(yōu)點(diǎn),例如:可以快速擴(kuò)大轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的群體,且能保持外源基因穩(wěn)定傳遞.將克隆動(dòng)物進(jìn)行再次克隆,可以研究體細(xì)胞積累的變異對(duì)個(gè)體發(fā)育、繁殖和健康的影響.該實(shí)驗(yàn)以轉(zhuǎn)基因克隆山羊的卵巢顆粒細(xì)胞和耳尖成纖維細(xì)胞為供核細(xì)胞,以超排得到的MⅡ期卵母細(xì)胞去核后作為供質(zhì)細(xì)胞,進(jìn)行核移植.將供核細(xì)胞注射到去核卵母細(xì)胞的卵周隙,經(jīng)電融合獲得重構(gòu)胚,再經(jīng)離子霉素(Ionomycin,5

2、 μ M,5min)和6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP,2mM,5h)處理激活.結(jié)果:(1)融合率:顆粒細(xì)胞為49.3％,成纖維細(xì)胞為56.2％:(2)桑葚胚/囊胚率:顆粒細(xì)胞為25％,成纖維細(xì)胞為32.7％;(3)成功率(產(chǎn)仔數(shù)/重構(gòu)卵數(shù)):顆粒細(xì)胞為1.1％,成纖維細(xì)胞為1.3％;(4)共出生羔羊5只,存活2只;(5)經(jīng)PCR-RFLP鑒定,各出生羔羊確為供核細(xì)胞的克隆山羊.經(jīng)PCR鑒定,各繼代克隆羊均繼承了供核山羊攜帶的外源基因(

3、Neo<'r>基因).為檢測(cè)Neo<'r>基因的表達(dá)情況,分別取供核山羊和繼代克隆山羊的耳尖成纖維細(xì)胞,用含800μg/ml G418的培養(yǎng)液進(jìn)行抗性培養(yǎng),結(jié)果各細(xì)胞表現(xiàn)的抗藥性有差異.由此證實(shí),(1)成年轉(zhuǎn)基因克隆山羊的成纖維細(xì)胞和顆粒細(xì)胞能夠在MⅡ期卵母細(xì)胞質(zhì)的作用下去分化、重新編程,并發(fā)育得到個(gè)體,效率與普通山羊體細(xì)胞核移植效率相當(dāng);(2)通過(guò)核移植可以將外源基因穩(wěn)定傳遞給后代,但是,在體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中,外源基因的表達(dá)情況各