轉(zhuǎn)基因克隆兔相關(guān)影響因素的研究.pdf

1、一、對兔卵母細(xì)胞的孤雌激活方法進(jìn)行探討，為兔體細(xì)胞核移植的研究奠定良好基礎(chǔ)。將體外成熟培養(yǎng)20～22h的兔卵母細(xì)胞隨機(jī)分組，分別進(jìn)行以下試驗(yàn)：采用不同脈沖電壓、脈沖次數(shù)和脈沖時(shí)間，電激活兔卵母細(xì)胞，摸索最佳電激活參數(shù)；比較不同激活方法處理兔卵母細(xì)胞的激活效果，I:Ion5min+6-DMAP3h,Ⅱ:Ion5min+CHX3h,Ⅲ:Ion5min+6-DMAP聯(lián)合CHX3h，Ⅳ：電激1次聯(lián)合6-DMAP+CHX3h；優(yōu)化6-DMAP與C

2、HX作用時(shí)間。結(jié)果顯示：當(dāng)電激參數(shù)為：電壓40V/mm，脈沖時(shí)間20μs和脈沖次數(shù)3次時(shí)，兔孤雌胚的分裂率和囊胚率最高，可達(dá)80.64％和14.51％;采用第Ⅳ種方法激活兔的卵母細(xì)胞，胚胎的分裂率和囊胚率(80.64％，13.71％)均顯著高于Ⅰ組(66.67％，8.6％)和Ⅱ組(43.21％，1.24％，p<0.05)，略高于第III組(77.59％，12.07％)；當(dāng)兔孤雌胚分別在含6-DMAP和CHX的CM中培養(yǎng)lh和3h時(shí)，lh

3、組在分裂率(80.68％ Vs77.59％)和囊胚率(15.91％Vs12.07％)上都略高于3h處理組，但差異不顯著(p>0.05)。
　　 二、對兔孤雌激活胚胎培養(yǎng)的條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在建立一個(gè)完善的兔胚胎體外培養(yǎng)體系，為兔體細(xì)胞核移植的研究奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)一：探討三種不同的培養(yǎng)基(CM、M-199、G1/G2)對兔孤雌胚胎體外發(fā)育效果的影響；試驗(yàn)二：比較分別采用不更換培養(yǎng)液、每天更換培養(yǎng)液、隔天更換培養(yǎng)液方法培養(yǎng)兔孤雌胚胎的體

4、外發(fā)育效果；試驗(yàn)三：在M-199+10％FBS的培養(yǎng)液中添加一定量的氨基酸，探討氨基酸對兔孤雌胚發(fā)育的影響。結(jié)果顯示：兔孤雌胚胎在M-199+10％FBS組培養(yǎng)其分裂率和囊胚率(79.59％，14.28％)均顯著高于CM組(47.48％，5.75％)和G1/G2組(21.00％，0.00％)(P<0.05)。采用每天更換或隔天更換培養(yǎng)液的方法培養(yǎng)兔孤雌激活的胚胎，這兩組胚胎的卵裂率（76.39％和79.59％）與不更換培養(yǎng)液的對照組(7

5、3.68％)相比，三組之間差異不顯著(P>0.05)，但這兩組的囊胚發(fā)育率(9.72％和14.28％)顯著的高于對照組(1.75％)(P<0.05)，而這兩組之間差異不顯著(P>0.05)。在M-199培養(yǎng)液中添加氨基酸后，囊胚發(fā)育能力顯著高于對照組(29.88％ VS13.92％，P　　 三、以非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)GFP基因的兔胎兒成纖維細(xì)胞做核供體，進(jìn)行了兔的體細(xì)胞核移植試驗(yàn)。結(jié)果顯示：(1)血清饑餓處理3～5d的非

6、轉(zhuǎn)基因兔胎兒成纖維細(xì)胞核移植后其重構(gòu)胚的囊胚率顯著高于不處理組和處理6-9d組（33.33％ VS22.47％和23.61％，P<0.05）；(2)轉(zhuǎn)GFP基因與非轉(zhuǎn)基因兔胎兒成纖維細(xì)胞核移植后重構(gòu)胚的融合率(76.27％ VS73.12％)和分裂率(82.22％ VS72.06％)沒有顯著差異(P>0.05)，但囊胚發(fā)育率差異顯著(20.59％ VS33.33％，P<0.05)；(3)比較3種不同方法（脂質(zhì)體法、磷酸鈣法和電穿孔法）轉(zhuǎn)

7、染的兔胎兒成纖維細(xì)胞核移植后重構(gòu)胚的發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)用電穿孔法轉(zhuǎn)染的兔胎兒成纖維細(xì)胞其重構(gòu)胚的囊胚發(fā)育率顯著高于脂質(zhì)體法和磷酸鈣法（44.44％ VS20.59％和20.00％，P　　 以上結(jié)果表明：(1)兔卵母細(xì)胞經(jīng)Ion處理5min，或先電激1次（參數(shù)為電壓40 V/mm脈沖時(shí)間20μs，脈沖3次），再用2