13928.piggybac轉座子載體的構建與在牛成纖維細胞轉座位點的分析

1、分類號Q812UDC576學校代碼10129學號2010211010PiggyBac轉座子載體的構建與在牛成纖維細胞中轉座位點的分析PiggyBacTransposonConstructionInBovineFibroblastCellsTranspositionSeatAnalysis申請人：白宏偉學科門類：理學學科專業(yè)：發(fā)育生物學研究方向：動物遺傳與發(fā)育指導教師：周歡敏教授論文提交日期：二○一三年六月摘要本研究利用piggybac轉

2、座子為載體將嗜熱菌糖苷酶(LacS)基因整合到牛成纖維細胞的基因組中，并分析了piggybac轉座子在牛成纖維細胞中的轉座效率和轉座位點的特性。同時，在研究中探討了轉座子和轉座酶二元載體轉染牛成纖維細胞時的最佳比例。1從Puc57載體上克隆的LacS和BLG表達框與從pZGL載體上克隆到的ZGL表達框相連，并且擴增ZGL表達框時設計的上游引物中引入NotⅠ、AflⅡ、NheⅠ酶切位點，下游引物引入SalⅠ、HindⅢ酶切位點，兩個表達框

3、經(jīng)酶切連接后得到質粒pZGLLacS，測序鑒定。2通過PCR從pLOXEGFP上克隆PGKNEO片段，并在設計引物時在上游引物5’端引入NheⅠ酶切位點，下游引物3’端加2A和BamHⅠ，然后用NheI，BamHI酶切將得到的片段連接到pEGPFN1載體中，新構建的質粒記為pEGFPNEON1，再從此質粒上克隆PGKNEOEGFP表達框，然后用NheⅠ和AflⅡ雙酶切，連接到已經(jīng)構建好的載體pZGLLacS中，測序鑒定。3將轉座子和轉座

4、酶載體以5：1的比例轉染牛成纖維細胞。然后將轉基因細胞分別以1：301:601:100三個梯度稀釋傳代，篩選單克隆細胞，培養(yǎng)液內(nèi)G418的濃度為600ugml。在這三種不同的稀釋濃度下分析添加和不添加轉座酶對細胞單克隆形成的影響?？捡R斯亮藍染色后得到的結果為不添加轉座酶的的組沒有能形成單克隆，與添加了轉座酶的組差別極顯著。4為了找到轉座子與轉座酶的最佳比例，將轉座子轉座酶的比例梯度設為10:15:12:11:21:51:10，細胞傳代比