不同轉(zhuǎn)座子在豬和鼠胎兒成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)座活性的比較研究.pdf

1、轉(zhuǎn)座子(Transposon，Tn)，是染色體上可自主復(fù)制和移位的基本單位，普遍存在生物體基因組內(nèi)，轉(zhuǎn)座子從一個(gè)基因位點(diǎn)插入到另一個(gè)基因位點(diǎn)的過程稱為轉(zhuǎn)座。Sleeping beauty(SB)、piggyBack(PB)、Tol2是目前研究應(yīng)用較多的3種DNA轉(zhuǎn)座子。為了探討此3個(gè)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的轉(zhuǎn)座特性，本研究將含轉(zhuǎn)座元件的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物豬和小鼠胎兒成纖維細(xì)胞（PEF和MEF），通過優(yōu)化相關(guān)參數(shù)，系統(tǒng)比較了轉(zhuǎn)座活性差異，為轉(zhuǎn)基

2、因和功能基因捕獲研究提供重要參考。本實(shí)驗(yàn)主要包括:
　　1.用高保真PCR法克隆綠色熒光蛋白eGFP編碼區(qū)，經(jīng)序列測定正確后，亞克隆至載體pGL3-SV40啟動(dòng)子下游，然后將SV40-EGFP表達(dá)框克隆至SB轉(zhuǎn)座子載體pT2-HB，構(gòu)建成轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體，命名為pT2-SV40-EGFP。將此重組質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體Lipo-fectamineTM2000包裹轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞(PEF)，48小時(shí)后通過熒光顯微鏡觀察報(bào)告基因的表達(dá)。結(jié)果表

3、明，PEF細(xì)胞轉(zhuǎn)染率較高（大于50％），且PT2-SV40-EGFP能有效表達(dá)。提示Lipo-fectamineTM2000可高效包裹轉(zhuǎn)座子載體轉(zhuǎn)染胎兒成纖維細(xì)胞，為后繼實(shí)驗(yàn)提供參考。
　　2.用分子克隆方法將PB和Tol2轉(zhuǎn)座元件克隆至pT2-HB，從而構(gòu)建成含三種轉(zhuǎn)座子的重組載體，命名為pT3-PST;再用內(nèi)切酶將CAG-GFP表達(dá)盒從載體pCAG-GFP中切出，亞克隆至pT3-PST，構(gòu)建成表GFP的多轉(zhuǎn)座子載體，命名為pT

4、3-PST-CAG-GFP載體。將此重組載體用上述方法轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞(PEF)和小鼠胎兒成纖維細(xì)胞(MEF)，結(jié)果表明，pT3-PST-CAG-GFP載體在兩種細(xì)胞中均能有效轉(zhuǎn)染和表達(dá)，提示該載體構(gòu)建成功，可用于轉(zhuǎn)座特性研究。
　　3.為了比較SB11、SB16、SB100x三種轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)座活性，按照DNA質(zhì)量比10∶1比例將pT3-PST-CAG-GFP和表達(dá)上述三種轉(zhuǎn)座酶的載體分別混合，經(jīng)脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染PEF和MEF。通

5、過熒光顯微鏡和熒光定量PCR法(RT-QPCR)檢測GFP表達(dá)水平和插入效率。結(jié)果表明，SB100x介導(dǎo)外源基因插入基因組拷貝數(shù)及GFP轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于SB11和SB16，提示SB100x具有較高轉(zhuǎn)座活性，可用于SB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)特性研究。
　　4.為了比較SB、PB和Tol2轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座效率，將pT3-PST-CAG-GFP分別和三種轉(zhuǎn)座酶載體SB100x、PBase及Tol2TBase共轉(zhuǎn)染PEF和MEF細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置不同的質(zhì)量比

6、梯度:10∶1、5∶1、1∶1、1∶5和1∶10。通過熒光顯微鏡和RT-QPCR法檢測GFP表達(dá)水平和插入效率。結(jié)果表明，SB介導(dǎo)外源基因插入基因組拷貝數(shù)及GFP轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于PB和Tol2，提示SB系統(tǒng)轉(zhuǎn)座活性優(yōu)于PB和Tol2。結(jié)果還表明三者獲得最高轉(zhuǎn)座率的轉(zhuǎn)染質(zhì)量比不同，其中SB、PB在PEF及MEF中最高轉(zhuǎn)座率的轉(zhuǎn)染質(zhì)量比相同，SB系統(tǒng)為1∶1，PB系統(tǒng)為1∶10，Tol2系統(tǒng)在PEF及MEF中最高轉(zhuǎn)座率的轉(zhuǎn)染質(zhì)量比不同，P