表達(dá)豬端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)座子載體的構(gòu)建及其在豬細(xì)胞永生化中的應(yīng)用.pdf

1、何姍：表達(dá)豬端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)座子載體的構(gòu)建及其在豬細(xì)胞永生化中的應(yīng)用表達(dá)豬端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)座子載體的構(gòu)建及其在豬細(xì)胞永生化中的應(yīng)用碩士研究生：何姍導(dǎo)師：孫懷昌教授摘要細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)、病毒分離培養(yǎng)與疫苗研發(fā)等研究領(lǐng)域不可欠缺的常用工具。細(xì)胞系具有一定的體外增殖能力，主要包括自發(fā)永生化細(xì)胞系和癌基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，前者為正常細(xì)胞，但自然發(fā)生幾率很低；后者的建立相對容易，但細(xì)胞的核型、表型、分化等具有不同程度的改變，而且因含癌

2、基因、抗性基因、病毒序列等安全隱患。因此，建立不含癌基因、抗性基因和病毒序列的永生化細(xì)胞系具有很好的應(yīng)用價(jià)值。端粒(telomere)是真核細(xì)胞染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞分裂和衰老密切相關(guān)。端粒酶負(fù)責(zé)端粒的復(fù)制，由端粒RNA、端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(telomerasereversetranscriptase，TERT)與端粒酶相關(guān)蛋白組成。研究實(shí)驗(yàn)資料顯示，導(dǎo)入外源TERT基因不僅可使原代細(xì)胞永生化，而且建立的永生化細(xì)胞系為正常細(xì)胞?；?qū)?/p>

3、入方法主要有重組載體轉(zhuǎn)染法和病毒載體轉(zhuǎn)化法，前者基因轉(zhuǎn)染效率較低，通常需用抗性篩選來獲得穩(wěn)定的細(xì)胞克隆：后者轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高，但存在病毒序列等安全隱患。轉(zhuǎn)座子(transposon)是細(xì)胞基因組內(nèi)可移動(dòng)序列，不僅可作為基因轉(zhuǎn)移載體，而且基因轉(zhuǎn)移效率較高，不需通過抗性篩選即可獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆。本研究將轉(zhuǎn)座子的基因轉(zhuǎn)移高效性與TERT的細(xì)胞永生化相結(jié)合，先以豬蛋白翻譯延伸因子la(elongationfactorla，EFla)啟動(dòng)子和生

4、長激素polyA信號(hào)，構(gòu)建SB轉(zhuǎn)座子載體。經(jīng)用綠色熒光蛋白報(bào)告基因細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)證明，豬源EF1a啟動(dòng)子能在豬細(xì)胞中有效驅(qū)動(dòng)目的基因表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄活性與人巨細(xì)胞病毒的強(qiáng)早期啟動(dòng)子相當(dāng)；用重組轉(zhuǎn)座子載體與轉(zhuǎn)座酶載體共轉(zhuǎn)染豬成纖維細(xì)胞，反復(fù)傳代后計(jì)數(shù)熒光陽性細(xì)胞克隆，結(jié)果顯示SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)能有效介導(dǎo)報(bào)告基因整合。然后，用RTPCR從豬源細(xì)胞克隆TERTcDNA，插入SB轉(zhuǎn)座子載體，將重組載體何姍：表達(dá)猜端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)座子載體的構(gòu)建及其在豬細(xì)胞

5、永生化巾的應(yīng)用3ConstructionofPorcineTelomeraseReverseTranscriptaseExpressionTransposonVectorandItsApplicationinPorcineCellImmortalizationAbstractCellculturetechnologyisanimportantresearchtoolincellbiologyvirusisolationandpropag

6、ation，andvaccineproductionCelllineshaveunlimitedpropagationcapabilityinvitro，includingspontaneousimmortalizedcelllinesandcancerorviralgene—transformedcelllinesThespontaneousimmortalizedcellsarenormalcells，buttheiroccurre

7、nceisveryrareThetransformedcelllinesarerelativelyeasytoestablish，buthavebiosafetyconcerrlSduetothepresenceantibioticresistantand／orviralgenesTherefore，theimmortalizedcelllineswithoutantibioticresistantand／orviralgeneshav

8、eextensiveapplicationsincellbiologyandvaccinedevelopmentTelomereisaspecialstructureattheendsofeukaryoticchromosomesandplaysimportantrolesincellpropagationandagingThetelomereDNAisreplicatedbytelomerase，whichconsistsoftelo

9、mereRNA，telomereassociatedproteinsandtelomerasereversetranscriptase(TERT)PreviousstudieshaveshownthatTERTgenetransfercanbeusedtoestablishimmortalizedcelllinesThemaingenetransfermethodsincludeplasmidvectortransfectionandv

10、iralvectortransductionTheformermethodhasalowefficiencyandneedsantibioticresistantselectionforstablytransfectedcellclones，whilethelatermethodisrelativelyeasywithbiosafetyconcernsTransposonsaremobilesequenceswithincellgeno

11、mesandhavebeenusedasgenetransfervectorsDuetotheirhighertransfectionefficiencyandabilitytomediateforeigngeneintegrationintohostcells，noantibioticselectionisneededforgenerationofstablytransfectedcelllinesBycombiningtranspo

12、son—mediatedgenetransferwithTERTmediatedcellimmortalization，inthisstudyasleepingbeauty(SB)transposonvectornamedaspTEGwasconstructedbyusingporcineelongationfactorla(EF—la)promoterandbovinegrowthhormonepolyAsignalByusinggr