CD14、IL-6、CRP與冠心病相關(guān)性研究.pdf

1、目的：與冠心病相關(guān)的危險因素較多，近年來冠心病發(fā)病的炎癥學(xué)說越來越得到重視，革蘭陰性菌所致慢性感染及炎癥反應(yīng)可能與動脈粥樣硬化的形成有關(guān)。感染可引起機(jī)體發(fā)生固有性免疫應(yīng)答，進(jìn)而釋放一些炎性因子，如CRP和IL-6等。CD14作為脂多糖(LPS)的受體可介導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等活化進(jìn)而促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的釋放，參與冠心病的發(fā)生、發(fā)展。很多研究都顯示CD14啟動子C(-260)T基因點(diǎn)突變和冠心病之間存在一定關(guān)系，目前這一基因多態(tài)性與冠

2、心病的關(guān)系還存在爭議，本試驗主要通過檢測冠心病患者CD14啟動子C(-260)T基因點(diǎn)突變情況，同時測定血漿中IL-6與CRP含量，旨在分析這些相關(guān)因素與冠心病的關(guān)系。從固有免疫的角度探討冠心病的可能致病機(jī)制。 方法： 1標(biāo)本的收集與處理 收集冠心病(CAD)病人的抗凝血標(biāo)本115例，平均年齡(62.58±12.73)歲。健康對照標(biāo)本60例，平均年齡(59.45±12.03)歲。分離血漿與細(xì)胞成分，血漿于-86℃

3、保存，供測定IL-6、CRP含量；用鹽酸胍法提取血細(xì)胞中DNA，-86℃冰凍保存，供CD14啟動子基因突變檢測。 2測試標(biāo)本(1)用PCR-RFLP法測試CD14啟動子-260位點(diǎn)基因突變：擴(kuò)增體系為50μl，其中10×Buffer5μl，dNTP(2.5mmol/L)4μl，primerl(20μmol/L)1μl，primer2(20μmol/L)1μl，TaqDNA聚合酶(5U/μl)0.3μl，模板4μl，滅菌三蒸水補(bǔ)至

4、50μl。擴(kuò)增參數(shù)為：預(yù)變性94℃5分鐘，變性94℃45秒、58℃45秒，延伸72℃1分鐘，循環(huán)30次，末延伸72℃5分鐘。 擴(kuò)增產(chǎn)物用TAE配制含0.5μg/ml溴化乙啶的2％瓊脂糖凝膠電泳，加樣5μl/孔，電泳4V/cm，30分鐘；PCRMarker作為參照，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析。對擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶(HaeⅢ)酶切：酶切體系為20μl，其中：HaeⅢ(10U/μl)1μl，10×Buffer2μl，DNA擴(kuò)增產(chǎn)物17μl

5、。37℃水浴反應(yīng)4小時。酶切結(jié)果用3％的瓊脂糖凝膠電泳分析。(2)血漿IL-6含量測定：按IL-6ELSA試劑盒說明書。(3)免疫比濁法測定Hs-CRP含量，在全自動生化分析儀上進(jìn)行。 結(jié)果： 1冠心病組、健康對照組CD14啟動子C(-260)T基因點(diǎn)突變頻率 115例冠心病人中，野生型(CC)為20例，占17.4％；突變雜合子型(TC)為44例，占38.3％；突變純合子型(TT)為51例，占44.3％?；蝾l率

6、分別為T為63.5％，C為36.5％。60例健康對照中，野生型(CC)為13例，占21.67％；突變雜合子型(TC)為28例，占46.67％；突變純合子型(TT)為19例，占31.67％?；蝾l率分別為T為55.00％，C為45.00％。健康對照組和冠心病組基因型頻率(χ2=2.644，p=0.267)、等位基因頻率(χ2=2.373，p=0.123)差別無統(tǒng)計學(xué)意義。 2血漿IL-6含量測定 115例冠心病人血漿IL-

7、6含量的平均值為32.170±17.377ng/L；60例健康對照組血漿IL-6含量的平均值為24.124±3.107ng/L。二者均值比較差別有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.553，p＜0.01)。 3冠心病病人不同基因型組血漿IL-6含量比較 在115例冠心病病人血漿中，CC基因型組IL-6平均值為31.309±12.952ng/L，TC基因型組IL-6平均值為33.668±22.201ng/L，TT基因型組IL-6平均值

8、為31.014±13.437ng/L，經(jīng)Oneway-ANOVA分析，F(xiàn)=0.294，p=0.749，組間無統(tǒng)計學(xué)差異。 4血漿CRP含量的測定 115例冠心病人血漿CRP含量的平均值為10.325±12.133mg/L；60例健康對照組血漿CRP含量的平均值為1.488±1.558mg/L。二者均值比較差別有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.610，p＜0.001)。 5冠心病病人不同基因型組血漿CRP含量比較

9、在115例冠心病病人血漿中，CC基因型組CRP平均值為12.020±14.662mg/L，TC基因型組CRP平均值為8.046±9.316mg/L，TT基因型組CRP平均值為11.817±12.980mg/L，經(jīng)Oneway-ANOVA分析，F(xiàn)=1.415，p=0.247，組間無統(tǒng)計學(xué)差異。 6冠心病組血漿中CRP與IL-6含量的相關(guān)性分析結(jié)果 115例冠心病病人中，血漿CRP與IL-6含量的Pearson相關(guān)系數(shù)r=0

10、.382，p＜0.01。經(jīng)線性回歸分析，二者之間存在直線關(guān)系，直線回歸方程為：Y=0.267*X+1.7431。 7冠心病病人不同基因型組血漿甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)含量比較 不同基因型組間血漿甘油三酯(TG)(F=1.656，p=0.196)、總膽固醇(TC)(F=0.767，p=0.467)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL)(F=0.076，p=0.927)含量比較均無統(tǒng)計學(xué)差異。

11、 結(jié)論： 1.冠心病組、健康對照組CD14C(-260)T基因頻率比較 本研究首次研究了CD14啟動子(C-260T)基因在中國北方漢族健康人和冠心病病人中點(diǎn)突變情況。冠心病組基因型突變頻率與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=2.644，p=0.267)。T等位基因頻率與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=2.373，p=0.123)。 2.冠心病組血漿IL-6水平高于健康對照組(t=3.553，p＜0.01)。 3.冠

12、心病組CD14啟動子不同基因型血漿IL-6水平無統(tǒng)計學(xué)差異(F=0.294，p=0.749)。 4.冠心病組血漿CRP水平高于健康對照組(t=5.610，p＜0.001)。 5.冠心病組CD14啟動子不同基因型血漿CRP水平無統(tǒng)計學(xué)差異(F=1.415，p=0.247)。 6.冠心病組血漿IL-6與CRP水平有相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.382，p＜0.01，經(jīng)線性回歸分析，二者之間存在直線關(guān)系，直線回歸方程為：Y