豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒疫苗的研制.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus2，PCV2)是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原，其主要感染6~18周齡的仔豬，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性消瘦、發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、黃疸和呼吸困難等癥狀。PCV2引起的相關(guān)疾病表現(xiàn)為世界流行，已經(jīng)給世界各國(guó)的養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成了巨額經(jīng)濟(jì)損失，疫苗接種是控制該病毒在豬群中的爆發(fā)最有效的方法。目前市場(chǎng)上的PC

2、V2商品化疫苗主要包括全病毒滅活苗和亞單位疫苗兩種，全病毒滅活苗方面，由于病毒自身的特點(diǎn)和生產(chǎn)工藝的問(wèn)題，經(jīng)常出現(xiàn)病毒滴度難以提高等技術(shù)問(wèn)題，有時(shí)需要濃縮才能達(dá)到要求。亞單位疫苗主要是使用桿狀病毒表達(dá)目的蛋白，免疫原性良好，但因其生產(chǎn)成本很高，難以在養(yǎng)殖生產(chǎn)中大規(guī)模使用。因此有必要研制高效實(shí)用、成本低廉的豬圓環(huán)疫苗，用以減少該病毒對(duì)養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成的損失。
　　本研究主要探索了可以形成病毒樣顆粒的PCV2全長(zhǎng)Cap蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中

3、的表達(dá)，并將表達(dá)的目的蛋白制成病毒樣顆粒疫苗，以小鼠為模型評(píng)價(jià)該顆粒疫苗的免疫原性，主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　1.重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)
　　以流行毒株P(guān)CV2b119-GD01株編碼Cap的氨基酸序列作為基礎(chǔ)序列，進(jìn)行密碼子優(yōu)化和基因合成，得到目的基因rORF2，并將rORF2克隆到原核表達(dá)載體pET-43.1a中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot分析顯示，誘導(dǎo)的融合蛋白約為100 KDa左

4、右，并且主要以可溶形式存在，目的蛋白占上清總蛋白的50％以上；通過(guò)鎳柱親和層析和凝血酶的進(jìn)一步純化，得到了高純度的不含標(biāo)簽的Cap蛋白，并且重組蛋白和純化后的無(wú)標(biāo)簽?zāi)康牡鞍拙cPCV2 Cap蛋白單抗具有良好的反應(yīng)性。在電鏡下觀察純化后的Cap蛋白，可以看到大量直徑約為17 nm的病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒與豬圓環(huán)病毒粒子的大小和結(jié)構(gòu)相似。
　　2.病毒樣顆粒疫苗佐劑的篩選
　　將表達(dá)的Cap蛋白分別與ISA201VG、ISA

5、15VG、GEL01、鋁膠佐劑乳化或混合制成疫苗，免疫小鼠，每周檢測(cè)小鼠血清中針對(duì)Cap蛋白的特異性抗體水平。結(jié)果顯示，鋁膠佐劑組小鼠血清的特異性抗體在第二周即轉(zhuǎn)陽(yáng)，并且該組的抗體水平在首免后4~7周均高于商品化亞單位疫苗組，即陽(yáng)性對(duì)照組，但略低于ISA201VG佐劑組，綜合各佐劑的成本以及誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體的時(shí)間、水平等因素，篩選鋁膠佐劑做為PCV2病毒樣顆粒疫苗的候選佐劑。
　　3.病毒樣顆粒疫苗免疫次數(shù)的篩選
　　

6、以鋁膠作為佐劑制備病毒樣顆粒疫苗，分別采用免疫1次和免疫2次的免疫方式。免疫后血清中特異性抗體水平檢測(cè)結(jié)果顯示，免疫1次組和免疫2次組血清轉(zhuǎn)陽(yáng)均發(fā)生在第二周，且早于陽(yáng)性對(duì)照組；整體抗體水平免疫1次組稍低于免疫2次組，但差異不明顯，但二者均顯著高于商品化亞單位疫苗組。綜合血清轉(zhuǎn)陽(yáng)時(shí)間以及抗體水平等因素，初步選擇該病毒樣顆粒疫苗的免疫次數(shù)為1次。
　　4.病毒樣顆粒疫苗抗原免疫劑量的篩選
　　試驗(yàn)組中每只小鼠按照20μg、40μ

7、g、60μg和80μg Cap蛋白的量進(jìn)行免疫，檢測(cè)免疫后各組特異性抗體產(chǎn)生情況。結(jié)果表明，血清中特異性抗體水平與免疫的抗原含量呈正相關(guān)；當(dāng)免疫的抗原含量達(dá)到40μg每只小鼠時(shí)，即可在免疫后第三周甚至是第二周在小鼠體內(nèi)檢測(cè)到較高的抗體水平。初步確定小鼠的免疫劑量為每只每次40μg Cap蛋白。
　　本文將通過(guò)原核系統(tǒng)表達(dá)的PCV2 Cap蛋白與鋁膠佐劑混合，制成了PCV2病毒樣顆粒疫苗。使用含有40μg Cap蛋白的該病毒樣顆粒疫