黃病毒通用引物RT-PCR以及Real-Time PCR方法的建立并應(yīng)用于蚊蟲(chóng)檢測(cè).pdf

1、黃病毒科 (Family Flaviviridae)共有70余種病毒，其中黃病毒屬(GenusFlavivirus)日本腦炎病毒復(fù)合組(Japanese encephalitis virus complex)的病毒大多為經(jīng)蚊蟲(chóng)、蜱等媒介傳播的蟲(chóng)媒病毒 (arthropod-borne viruses，arbovirus)，包括乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、登革病毒(Dengue viru

2、s，DEN)、黃熱病毒(Yellow fever virus，YFV)、西尼羅病毒(West Nile virus，WNV)，圣路易斯腦炎(St．Louis encephalitis virus，SLE)等。乙型腦炎主要流行于亞洲地區(qū)，登革熱/登革出血熱在亞洲、太平洋地區(qū)以及美洲的流行呈明顯上升趨勢(shì)，圣路易腦炎主要分布于北美和南美，西尼羅病毒在阿爾及利亞、俄羅斯、意大利和美國(guó)等地發(fā)生爆發(fā)流行，裂谷熱(Rift Valley fever，

3、RVF)自2000年9月首次在傳統(tǒng)疫區(qū)非洲以外地區(qū)——阿拉伯半島發(fā)現(xiàn)疫情。黃病毒屬中半數(shù)以上的病毒種類能夠致人和動(dòng)物感染，患病率高而治愈率低，容易留下一些嚴(yán)重的后遺癥，給人類健康帶來(lái)很大威脅。 由于黃病毒屬病毒所致疾病通過(guò)蚊或蜱等吸血媒介傳播，大多為人畜共患疾病，并缺乏有效的治療、預(yù)防和控制措施，因而容易導(dǎo)致嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，給疾病的預(yù)防和控制提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。以登革病毒、乙型腦炎病毒以及西尼羅病毒等為代表的黃病毒疫源地的擴(kuò)大

4、，更引起了世界各國(guó)的關(guān)注和擔(dān)憂。此外，國(guó)外報(bào)道的西尼羅病毒傳播媒介種類中，我國(guó)存在的種類有二帶喙庫(kù)蚊(麻翅庫(kù)蚊)(Culex bitaeniorhynchus)、白雪庫(kù)蚊(白霜庫(kù)蚊)(Cx．gelidusl)、尖音庫(kù)蚊復(fù)合種Cx．pipiens complex)各蚊種；白紋伊蚊(Aedes albopictus)、日本伊蚊(Ochlerotatusaponicus，騷擾蚊屬)、毛跗庫(kù)蚊(Cx．tarsalis)和埃及伊蚊(Ae．a(chǎn)egy

5、pti)、刺擾伊蚊(Ae.vexans)分別是有效和中等有效的媒介。為加強(qiáng)對(duì)黃病毒屬病毒的研究及其流行病學(xué)調(diào)查，應(yīng)對(duì)疾病早期預(yù)警的需求，亟待建立一套科學(xué)、簡(jiǎn)便、快速的蚊蟲(chóng)黃病毒檢測(cè)方法。 黃病毒屬病毒日本腦炎復(fù)合組屬于正鏈RNA病毒。以西尼羅病毒為例，長(zhǎng)度約11 kb，其病毒基因組RNA在5'端有一個(gè)Ⅰ型帽狀結(jié)構(gòu)(m<'7>GpppAmp)，3'端缺少聚腺苷酸序列，以CU-OH結(jié)尾。病毒基因組RNA可以直接作為mRNA從一個(gè)開(kāi)放

6、閱讀框內(nèi)翻譯出一條長(zhǎng)鏈前體蛋白，長(zhǎng)鏈前體蛋白被切割成至少十種成熟的蛋白，其中包括三種結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM和E蛋白)與七種非結(jié)構(gòu)蛋白。這些蛋白在病毒基因組上的編碼順序?yàn)椋篊-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5。其中NS5段是所有黃病毒屬病毒基因組的保守結(jié)構(gòu)域。本研究即基于此保守結(jié)構(gòu)域建立一套以RT-PCR為基礎(chǔ)的黃病毒屬特異性檢測(cè)方法，在有陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果的基礎(chǔ)上，再用病毒種特異性引物進(jìn)一步鑒定病毒。

7、 首先，將JEV (JEV SA14-14-2減毒活疫苗)接種于乳鼠腦，解剖瀕死乳鼠取腦，以此乳鼠腦的病毒懸液為抽提樣本；根據(jù)黃病毒屬病毒的保守結(jié)構(gòu)域NS5段設(shè)計(jì)引物，對(duì)JEV減毒活疫苗病毒液逆轉(zhuǎn)錄cDNA，同時(shí)取登革病毒cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所獲擴(kuò)增片斷與預(yù)期片段大小一致，驗(yàn)證了其引物的通用性；該RT-PCR方法的敏感性達(dá)到0.568 PFU/ml。在此基礎(chǔ)上，建立了基于此對(duì)通用引物、SYBR Green Ⅰ標(biāo)記的Real-T

8、ime PCR檢測(cè)方法，并用于檢測(cè)野外采集的蚊媒標(biāo)本。 由于西尼羅病毒已經(jīng)在全球許多國(guó)家(包括我國(guó)周邊國(guó)家)造成流行，可能會(huì)由遷飛的鳥(niǎo)類攜帶、擴(kuò)散，西尼羅病毒傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)很大，因而我國(guó)將該病毒列入可能傳入的新現(xiàn)傳染病病原體。在“十五”國(guó)家科技攻關(guān)項(xiàng)目：“新發(fā)寄生蟲(chóng)病媒介生物學(xué)監(jiān)測(cè)與預(yù)警系統(tǒng)的研究”資金資助下，本研究進(jìn)一步建立鑒別WNV的檢測(cè)方法。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，E蛋白是西尼羅病毒主要的抗原結(jié)構(gòu)蛋白，具有高度保守性。人工合成E蛋白

9、基因片段，連接到pMD18-T和pMD19-T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，鑒定陽(yáng)性質(zhì)粒，以此質(zhì)粒為模板的PCR產(chǎn)物作為TaqMan探針實(shí)時(shí)PCR(Real-Time PCR)方法的陽(yáng)性對(duì)照。將此PCR產(chǎn)物原液系列對(duì)數(shù)稀釋<'1>，Real-Time PCR 可檢測(cè)的最低稀釋度為1∶10<'8>，經(jīng)測(cè)定PCR產(chǎn)物的OD值，敏感度達(dá)到1 fg；而常規(guī)RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，反應(yīng)敏感度為1∶10<'7>(0.01 pg)。可見(jiàn)Real-Time P

10、CR的敏感性比常規(guī)RT-PCR 高10倍。以此方法還可以對(duì)蚊媒體內(nèi)的病毒進(jìn)行半定量。 基于以上建立的檢測(cè)方法，選擇江蘇、福建、云南、上海、新疆5個(gè)省、市、自治區(qū)的候鳥(niǎo)遷徙地、濕地自然保護(hù)區(qū)作為蚊媒觀察點(diǎn)采集蚊蟲(chóng)，并在新疆選點(diǎn)捕殺野鼠取其臟器進(jìn)行RT-PCR和Real-Time PCR檢測(cè)。將飽血蚊蟲(chóng)按照30只分為一個(gè)混合樣本組，樣本少時(shí)則每組少于30只；非飽血蚊蟲(chóng)50～60只為一混合樣本組；取野鼠臟器(肝、脾、腦)0.5 cm<

11、'3>為一樣本組。共檢測(cè)蚊蟲(chóng)樣本組261組，12539只，野鼠臟器樣本8組。用上述黃病毒屬通用引物RT-PCR擴(kuò)增，在江蘇沿海某濕地采集的蚊蟲(chóng)有陽(yáng)性擴(kuò)增，進(jìn)一步用病毒種特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，僅乙腦病毒特異性引物有陽(yáng)性擴(kuò)增，而登革病毒和西尼羅病毒特異性引物擴(kuò)增陰性。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物序列測(cè)定，該陽(yáng)性擴(kuò)增序列與乙型腦炎病毒基因序列一致。用SYBR Green Ⅰ染料Real-Time PCR法對(duì)上述269組樣品進(jìn)行檢測(cè)，有22組蚊蟲(chóng)樣本有

12、陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，這些標(biāo)本分別是從上海、江蘇、福建、云南和新疆5省的采集點(diǎn)捕獲。進(jìn)一步對(duì)這些陽(yáng)性擴(kuò)增樣本用TaqMan探針Real-Time PCR進(jìn)行西尼羅病毒的鑒定，未見(jiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，證明是非西尼羅病毒的黃病毒感染。進(jìn)一步的鑒定工作仍在進(jìn)行中。從蚊媒方面來(lái)監(jiān)測(cè)病毒感染，在傳染病監(jiān)測(cè)中屬于早期監(jiān)測(cè)、早期預(yù)測(cè)傳染病即將發(fā)生流行的方法。本研究針對(duì)檢測(cè)蚊媒中的黃病毒屬日本腦炎病毒組感染建立了一套簡(jiǎn)單、有效、快速的檢測(cè)方法，該方法可用于大批量的檢