牛IgG Fc受體線性配體結(jié)合表位鑒定.pdf

1、Fc受體(FcR)為特異親和免疫球蛋白(Ig)Fc片段的細(xì)胞表面分子，廣泛表達(dá)于免疫輔助細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，具有許多重要的生理功能，是體液免疫與細(xì)胞免疫的聯(lián)系紐帶，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用?？贵w介導(dǎo)的炎性反應(yīng)可通過激活型和抑制型FcR進(jìn)行調(diào)節(jié)，因此FcR是治療過敏和自身免疫性疾病理想的藥物靶標(biāo)。本研究利用化學(xué)合成多肽鑒定了牛IgGFc受體(FcγR)的線性配體結(jié)合表位，并分析了結(jié)合牛IgG的關(guān)鍵氨基酸殘基，是首次開展FcR線性配體結(jié)合表位

2、的探索研究，對深入了解FcγR-IgG相互作用的分子基礎(chǔ)有重要意義，為FcR靶標(biāo)藥物的分子設(shè)計提供新的思路。 牛IgG2Fc受體(boFcγ2R)是一類新型的FcγR，與人IgAFc受體(huFcαRⅠ)同源，胞外區(qū)含有2個Ig樣結(jié)構(gòu)域，通過遠(yuǎn)膜端結(jié)構(gòu)域(EC1)與牛IgG2特異結(jié)合。為在細(xì)胞表面表達(dá)受體分子，將boFcγ2R編碼區(qū)cDNA亞克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3，轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，通過G418抗性篩選和連續(xù)克隆化，獲

3、得了穩(wěn)定表達(dá)boFcγ2R的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，牛IgG2致敏雞紅細(xì)胞(IgG2-RBC)的玫瑰花環(huán)形成率達(dá)90％左右，為boFcγ2R的功能研究提供了良好的技術(shù)平臺。將boFcγ2R胞外區(qū)cDNA亞克隆到原核表達(dá)載體pET-28a，在大腸桿菌中高效表達(dá)了boFcγ2R胞外區(qū)，以快速稀釋復(fù)性方法從包涵體變性蛋白中回收了具有良好結(jié)合活性的boFcγ2R重組蛋白。為鑒定boFcγ2R的線性配體結(jié)合表位，在EC1結(jié)構(gòu)域設(shè)計合成boFcγ2R多肽，偶聯(lián)

4、于載體蛋白BSA；以Dot-blot檢測偶聯(lián)多肽與牛IgG2的結(jié)合，并對陽性多肽進(jìn)行進(jìn)一步缺失和突變分析。boFcγ2R的82-85位多肽FIGV具有特異結(jié)合牛IgG2的能力，為最短的IgG2有效結(jié)合多肽，表明boFcγ2R上存在牛IgG2的線性結(jié)合表位，位于受體EC1結(jié)構(gòu)域的F-G環(huán)；多肽突變分析表明，boFcγ2R線性配體結(jié)合表位的Phe82、Ile83和Val85是結(jié)合牛IgG2的關(guān)鍵氨基酸殘基。含有boFcγ2R線性配體結(jié)合表位

5、的偶聯(lián)多肽FIGVNW不僅有效抑制牛IgG2與可溶性boFcγ2R的結(jié)合，而且對boFcγ2R轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面的IgG2-RBC玫瑰花環(huán)形成也具有良好的抑制功效，表明該配體結(jié)合表位多肽具有調(diào)節(jié)牛IgG2與細(xì)胞表面boFcγ2R結(jié)合的能力，可用于FcR靶標(biāo)藥物的研究開發(fā)。 牛IgGFc受體Ⅰ(boFcγRⅠ)與人FcγRⅠ(CD64)同源，為牛IgG的高親和力受體，胞外區(qū)含有3個Ig樣結(jié)構(gòu)域，能高親和力結(jié)合牛IgG單體。將boFcγR

6、Ⅰ編碼區(qū)cDNA亞克隆到表達(dá)載體pcDNA3，在COS-7細(xì)胞表面表達(dá)受體分子，通過玫瑰花環(huán)試驗測定boFcγRⅠ的配體特異性，IgG1-RBC在boFcγRⅠ轉(zhuǎn)染細(xì)胞上形成明顯的玫瑰花環(huán)，但未發(fā)現(xiàn)IgG2-RBC結(jié)合，提示boFcγRⅠ特異親和牛IgG1而不結(jié)合牛IgG2。將boFcγRⅠ胞外區(qū)cDNA亞克隆到原核表達(dá)載體pGEX-6P-1，在大腸桿菌BL21中表達(dá)了boFcγRⅠ胞外區(qū)，但未能從包涵體中有效復(fù)性boFcγRⅠ重組蛋白

7、。為鑒定boFcγRⅠ的線性配體結(jié)合表位，在EC2結(jié)構(gòu)域設(shè)計合成boFcγRⅠ多肽，Dot-blot結(jié)果顯示boFcγRⅠ的142-149位多肽TNLSHNGI是特異結(jié)合牛IgG1的最短有效多肽，為boFcγRⅠ的線性配體結(jié)合表位，位于受體EC2結(jié)構(gòu)域E-F環(huán)；多肽突變分析表明，boFcγRⅠ線性配體結(jié)合表位的Thr142、Asn143、Leu144、Gly148和Ile149是結(jié)合牛IgG1的關(guān)鍵氨基酸殘基。 牛IgGFc受體

8、Ⅱ(boFcγRⅡ)與人FcγRⅡ(CD32)同源，胞外區(qū)含有2個Ig樣結(jié)構(gòu)域，為牛IgG的低親和力受體，特異親和牛IgG1但不結(jié)合牛IgG2。為在細(xì)胞表面表達(dá)受體分子，將boFcγRⅡ編碼區(qū)cDNA亞克隆到表達(dá)載體pcDNA3，轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，通過G418抗性篩選和連續(xù)克隆化，獲得了在COS-7細(xì)胞表面穩(wěn)定表達(dá)受體分子的boFcγRⅡ轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，其IgG1-RBC玫瑰花環(huán)形成率達(dá)90％左右，為boFcγRⅡ的功能研究提供了良好的技

9、術(shù)平臺。將boFcγRⅡ胞外區(qū)cDNA亞克隆到表達(dá)載體pcDNA3，轉(zhuǎn)染NS0細(xì)胞，利用G418抗性細(xì)胞誘生小鼠腹水，以鎳螯合層析純化boFcγRⅡ分泌蛋白，該重組蛋白特異結(jié)合牛IgG1。為鑒定boFcγRⅡ的線性配體結(jié)合表位，在EC2結(jié)構(gòu)域設(shè)計合成boFcγRⅡ多肽，Dot-blot分析表明boFcγRⅡ的122-131位多肽FYQDRKSKIF是特異結(jié)合牛IgG1的最短有效多肽，為boFcγRⅡ的線性配體結(jié)合表位，位于受體EC2結(jié)構(gòu)

10、域C-C'環(huán)；多肽突變結(jié)果顯示，以Ala置換Phe122、Tyr123、Arg126、Lys127、Ser128、Lys129或Phe131均導(dǎo)致boFcγRⅡ線性配體結(jié)合表位多肽喪失結(jié)合牛IgG1活性，提示boFcγRⅡ線性配體結(jié)合表位的上述氨基酸殘基為結(jié)合牛IgG1的所必需。 牛IgGFc受體Ⅲ(boFcγRⅢ)與人FcγRⅢ(CD16)同源，胞外區(qū)含有2個Ig樣結(jié)構(gòu)域，也是牛IgG的低親和力受體。為鑒定boFcγRⅢ的線性