受體亞基結(jié)合位點(diǎn)修飾性O(shè)viIL-2的表達(dá)與鑒定.pdf

1、目前臨床治療中使用的人IL-2為將其氨基酸序列第125位半胱氨酸(Cys)突變?yōu)楸彼?Ala),以保證IL-2上其余兩個(gè)Cys能夠形成正確的二硫鍵結(jié)構(gòu)。
　　最近五年,有研究者通過(guò)IL-2的單克隆抗體封閉了IL-2上與IL-2Rα(CD25)結(jié)合的相關(guān)位點(diǎn),結(jié)果這種新產(chǎn)生的IL-2-單克隆抗體復(fù)合物在體內(nèi)刺激效應(yīng)T細(xì)胞增殖的能力是天然IL-2的2倍以上,并顯著延長(zhǎng)了在生物體內(nèi)的半衰期。后續(xù)研究顯示,這種封閉了與IL-2Rα結(jié)合的

2、相關(guān)位點(diǎn)的IL-2-單克隆抗體復(fù)合物在對(duì)抗黑色素細(xì)胞瘤的治療過(guò)程中僅以1/40的劑量就可以起到與天然IL-2同等的效果,并且副作用微乎其微。
　　本研究通過(guò)生物信息學(xué)手段分析,對(duì)綿羊IL-2上與IL-2Rα結(jié)合有關(guān)的位點(diǎn)進(jìn)行突變,旨在使目的產(chǎn)物roIL-2不再對(duì)IL-2Rαβγ具有高親和性,從而達(dá)到與使用單克隆抗體封閉IL-2上與IL-2Rα結(jié)合的相關(guān)位點(diǎn)相似或更優(yōu)化的效果,即提高刺激效應(yīng)T細(xì)胞的增殖的能力,減少副作用。
　

3、　采用人工合成的方式合成了roIL-2的全序列,突變掉了綿羊IL-2基因上與IL-2Rα結(jié)合的相關(guān)位點(diǎn),并在該基因5′端設(shè)計(jì)上SnaB I酶切位點(diǎn),3′端設(shè)計(jì)上EcoR I酶切位點(diǎn)。使用SnaB I和EcoR I對(duì)合成基因進(jìn)行雙酶切,將roIL-2基因插入經(jīng)過(guò)相同雙酶切處理的畢赤酵母系統(tǒng)中分泌型表達(dá)載體pPIC9K中,經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定分析正確,成功地構(gòu)建了真核表達(dá)載體pPIC9K-roIL2。
　　將真核表達(dá)載體pPIC9K

4、-roIL2轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主菌GS115,經(jīng)過(guò)多輪篩選,得到了具有高濃度G418抗性的快甲醇利用型(Mut+)轉(zhuǎn)化子,命名為GS115-roIL2。使用MM培養(yǎng)基對(duì)GS115-roIL2進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將不同時(shí)段的誘導(dǎo)表達(dá)上清收集起來(lái)并使用羊IL-2 ELISA試劑盒進(jìn)行定量分析,發(fā)現(xiàn)經(jīng)72h的甲醇誘導(dǎo)表達(dá),上清液中roIL-2的含量約為1mg/L。通過(guò)SDS-PAGE分析顯示目的蛋白分子量大小約為15kDa,與理論預(yù)期相符。
　　

5、將誘導(dǎo)表達(dá)的roIL-2注入小鼠體內(nèi)檢測(cè)其對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的影響,以注射同等劑量的天然羊IL-2作為陽(yáng)性對(duì)照,發(fā)現(xiàn)在健康狀態(tài)下,注射roIL-2的小鼠血漿中CD4+/CD8+分子比值平均值為2.3945,高于注射正常綿羊IL-2的小鼠(1.2510)且效果極顯著;在抗病狀態(tài)下,注射roIL-2的小鼠血漿中CD4/CD8分子比值平均值為2.3712,同樣高于注射正常綿羊IL-2的小鼠(1.0168)且效果極顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明roIL-2相對(duì)