牛IgG Fc受體（FcγRⅡ，F(xiàn)cγRⅢ）的表達(dá)及其結(jié)合特性的鑒定.pdf

1、Fc受體（FcR）為特異親和免疫球蛋白（Ig） Fc片段的細(xì)胞表面分子，廣泛表達(dá)于免疫輔助細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，具有許多重要的生理功能，是體液免疫與細(xì)胞免疫的聯(lián)系紐帶，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用?？贵w介導(dǎo)的炎性反應(yīng)可通過激活型和抑制型FcR進(jìn)行調(diào)節(jié)，因此FcR為治療過敏和自身免疫性疾病提供了理想的藥物靶標(biāo)。為深入研究Fc受體的結(jié)構(gòu)與功能及IgG與FcγR的相互作用，本研究應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建了牛FcγR（FcγRⅡ，F(xiàn)cγRⅢ）原核表達(dá)載體和

2、真核表達(dá)載體，分別在大腸桿菌和COS—7細(xì)胞上進(jìn)行了表達(dá)；分離純化了牛IgG1、IgG2，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了FcγR—IgG結(jié)合區(qū)域的鑒定及其與IgG亞類結(jié)合特異性的功能實(shí)驗(yàn)。 牛IgG Fc受體Ⅱ（boFcγRⅡ與入FcyRⅡ（CD32）同源，胞外區(qū)含有2個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域，遠(yuǎn)膜端（membrane distal）為第一結(jié)構(gòu)域（extracellular domain1，EC1），近膜端（membrane proximal）為第

3、二結(jié)構(gòu)域（EC2）。boFcγRⅡ?yàn)榕gG的低親和力受體，特異親和牛IgG1但不結(jié)合牛IgG2。將boFcγRⅡ胞外區(qū)cDNA亞克隆到原核表達(dá)載體pET-28a T7啟動(dòng)子下游，在E coli BL21（DE3）中高效表達(dá)了boFcγRⅡ，SDS-PAGE和Western blotting結(jié)果表明，boFcγRⅡ表達(dá)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中主要以不溶性包涵體形式存在。為獲得功能性boFcγRⅡ蛋白，以鎳螯合親和層析為基礎(chǔ)建立柱內(nèi)復(fù)性技術(shù)，boF

4、cγRⅡ變性蛋白通過其兩端的His-tag標(biāo)簽結(jié)合于鎳螯合層析柱，并在線性降低的尿素濃度梯度復(fù)性溶液中逐漸復(fù)性，通過加入氧化型和還原型谷胱甘肽（GSSG/GSH）在2mol/L尿素濃度引入氧化還原環(huán)境，顯著提高功能性boFcγRⅡ的回收率。Dot-blot顯示boFcγRⅡ復(fù)性蛋白具有一定的生物活性，可特異結(jié)合牛IgG1。將boFcγRⅡ胞外區(qū)2個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域cDNA分區(qū)段亞克隆到原核表達(dá)載體pET-43．1a，經(jīng)IPTG在16℃過夜誘

5、導(dǎo)，獲得了可溶性boFcγRⅡ EC1、boFcγRⅡ EC2表達(dá)蛋白，Dot-blot分析表明boFcγRⅡ EC2是與boIgG1結(jié)合的主要功能區(qū)域，而boFcγRⅡ EC1與boIgG1的結(jié)合則相對較弱。 牛IgG Fc受體Ⅲ（boFcγRⅢ）與人FcγRⅢ（CD16）同源，胞外區(qū)含有2個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域，也是牛IgG的低親和力受體。利用融合PCR技術(shù)，將兩個(gè)低親合力受體boFcγRⅢ的胞外區(qū)和boFcγRⅡ的跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)

6、拼接產(chǎn)生一嵌合分子FcγRⅢ/Ⅱ。將FcγRⅢ/Ⅱ、boFcγRⅢ和boFcRγ-chain編碼區(qū)cDNA分別亞克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3，在COS-7細(xì)胞表面表達(dá)受體分子，通過玫瑰花環(huán)試驗(yàn)測定boFcγRⅢ的配體特異性，結(jié)果顯示，boFcγRⅢ和boFcRγ-chain質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，boFcγRⅢ/Ⅱ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞與IgG1紅細(xì)胞復(fù)合物形成明顯的玫瑰花環(huán)，但未發(fā)現(xiàn)IgG2-RBC結(jié)合。提示boFcγRⅢ特異親和牛IgG1而不