單個蛋白分子的測定及配體與受體在細胞表面結(jié)合和運動的研究.pdf

1、本文第一章對單分子檢測(SMD)的意義及常用的單分子檢測技術(shù)作了簡單介紹。SMD技術(shù)在生命科學(xué)上的應(yīng)用可以在單分子水平上揭示分子的動態(tài)行為、動力學(xué)過程和機制，并發(fā)現(xiàn)大量分子集合體中分子個體的性質(zhì)和行為。這一章中我們對在生物大分子SMD中應(yīng)用較為廣泛的技術(shù)：全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)(TIRFM)的原理等進行了介紹。對TIRFM用于分子馬達的運動、分子間相互作用、生物大分子的構(gòu)象變化等離體生物單分子探測作了詳細的綜述。對TIRFM用于細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

2、、細胞趨化性、離子通道等在體生物單分子探測作了詳細的綜述。 第二章中我們建立了一種新的、靈敏的全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)(TIRFM)的基于蛋白與玻片之間達到吸附平衡的單分子檢測(SMD)定量方法。在我們的工作之前文獻中用TIRFM檢測了羅丹明6G分子和羅丹明6G標(biāo)記的DNA分子，檢測限僅2.5 × 109 mol/L.我們用Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗鼠IgG(H+L)(Alexa Fluor 488 goat anti-

3、rat IgG(H+L)，IgG(H+L)-488)作為檢測蛋白.首先將IgG(H+L)-488在蓋玻片上孵育一定時間。IgG(H+L)-488在溶液和玻片之間達到吸附平衡后。使用安裝有電子多級放大電感偶合器(electronmultiplying charge coupled device，EMCCD)的TIRFM拍攝IgG(H+L)-488的熒光圖像。圖像中熒光點的數(shù)目為隱失場中IgG(H+L)-488分子吸附在蓋玻片上的數(shù)目和溶液

4、中的數(shù)目的總和。當(dāng)溶液的濃度在5.4×10-11～8.1×10-10 mol/L之間時，圖像中熒光點的數(shù)目與溶液中的IgG(H+L)-488濃度有良好的線性關(guān)系。線性范圍的下限比文獻報道的低了46倍。此部分內(nèi)容已發(fā)表在Anal.Chim。Acta雜志上。 第三章中我們在單分子水平對轉(zhuǎn)鐵蛋白與細胞膜上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運過程早期階段進行了研究。轉(zhuǎn)鐵蛋白-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運過程是生物體細胞最具特點的轉(zhuǎn)運過程之一.轉(zhuǎn)鐵蛋白-轉(zhuǎn)

5、鐵蛋白受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運過程的早期階段包括質(zhì)膜上轉(zhuǎn)鐵蛋白與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體復(fù)合物(TfR-Tf)的運動、聚集以及內(nèi)涵體的形成等，這些現(xiàn)象曾用形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)等方法進行研究，但大多將大量細胞溶解后通過直接測量放射性標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物的強度進行判斷。由于受大量細胞平均化檢測方法的限制，無法動態(tài)觀察這些過程。在本章中我們以單分子檢測方法中靈敏度高、對樣品損傷小的細胞內(nèi)TIRFM為主要檢測方式，對下列過程進行了實時動態(tài)的觀察。 1.實時動態(tài)觀察了溶液中

6、Tf-QD被質(zhì)膜上。TfR捕獲的過程。 2.在實時追蹤質(zhì)膜上TfR-Tf的聚集過程時，觀察到了質(zhì)膜上TfR-Tf通過擴散運動與質(zhì)膜上另一個已形成的TfR-Tf復(fù)合體聚集的過程。 3.在4℃下和37℃下通過觀測熒光點的運動來分析細胞膜上的TfR-Tf復(fù)合物及其側(cè)向運動，觀測到人的胃癌細胞膜上的TfP.在4℃和37℃時擴散的方式有自由擴散和受限擴散形式。并且通過熒光點的連續(xù)移動對應(yīng)于照片中的像素坐標(biāo)分別計算出了兩個溫度下Tf

7、R-Tf復(fù)合體的瞬時擴散系數(shù)。 上述在單分子水平上的研究結(jié)果，目前均未見文獻報道。 在第四章中我們在α1-腎上腺素受體的拮抗劑-藥物小分子哌唑嗪(prazosin)和α1-腎上腺素受體的激動劑-去氧腎上腺素(phenylephrine)鍵合上生物素(biotin).利用生物素與鏈酶親和素(streptavidin)之間極強的親和力將鏈酶親和素包被的量子點(QD-streptavidin)標(biāo)記到哌唑嗪和去氧腎上腺素上，并用

8、于觀察此兩藥物小分子與活細胞表面α1A-腎上腺素受體結(jié)合的情況。由于量子點獨特的優(yōu)良光學(xué)性質(zhì)，近年來用量子點標(biāo)記藥物小分子及用于細胞成像已有報道。然而，他們利用多步化學(xué)鍵合反應(yīng)將藥物小分子連接到量子點上的方法存在反應(yīng)產(chǎn)率低及分離提純等問題。而且用這種方法很難控制連接到量子點上藥物小分子的數(shù)目。另一種思路是首先將生物素連接到藥物小分子(生物素化藥物小分子)，這些生物素化藥物小分子然后與QD-streptavidin反應(yīng)將生物素化藥物小分子

9、結(jié)合到量子點上。文獻也報道了用這種思路將多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白的拮抗劑結(jié)合到量子點上，但未用于細胞的熒光成像。根據(jù)這種背景我們進行了下列的研究工作： 1.用與文獻完全不同的合成路線將生物素與藥物小分子哌唑嗪和去氧腎上腺素鍵合在一起，再與QD-streptavidin反應(yīng)將量子點標(biāo)記到哌唑嗪和去氧腎上腺素。這種標(biāo)記量子點的方法克服了文獻中化學(xué)鍵合反應(yīng)標(biāo)記法存在的反應(yīng)產(chǎn)率低及分離提純等問題，而且還可以控制每個量子點上連接到量子點上藥物小分子

10、的數(shù)目，因為每個量子點上包被的鏈酶親和素的量是一定的。由于QD-streptavidin已有商品，所以我們這種標(biāo)記量子點的方法十分方便，有利于在生命科學(xué)的研究中應(yīng)用。研究結(jié)果證明用這種方法標(biāo)記量子點的哌唑嗪和去氧腎上腺素仍具有藥理活性，可用于細胞的熒光成像。 2.研究了去氧腎上腺素與生物素之間連接不同鏈長的化合物時去氧腎上腺素與細胞表面α1A-腎上腺素受體結(jié)合的情況。發(fā)現(xiàn)在生物素與去氧腎上腺素之間的鏈越長，越易于與細胞表面α1A-腎上腺