生長因子受體結(jié)合蛋白10對Bim介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡影響的研究.pdf

1、在多細(xì)胞生物中，凋亡是一種正常的生理過程，該過程清除了多余的細(xì)胞，確保了胚胎發(fā)育和組織分化的完成，維持了體內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的動態(tài)平衡。細(xì)胞內(nèi)線粒體凋亡途徑是凋亡的主要途徑之一。線粒體途徑是由促凋亡和抗凋亡Bcl-2蛋白家族蛋白調(diào)控。Bim屬于BH3-only促凋亡蛋白，其首先被發(fā)現(xiàn)于和Bcl-2結(jié)合的蛋白中。到目前為止，至少有11種Bim的異構(gòu)體被報道。Bim EL、Bim L和Bim S可以與位于線粒體外膜的Bcl-2及Bcl-XL結(jié)合，從

2、而激發(fā)了細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡。Bim EL和Bim L可以與動力馬達(dá)蛋白復(fù)合體的動力蛋白輕鏈LC18結(jié)合，這種結(jié)合抑制了它們的促凋亡活性。當(dāng)外界應(yīng)激激活JNK途徑時，結(jié)合于細(xì)胞骨架上的Bim被磷酸化并從骨架上脫落激活。Bim S缺少可與動力蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域而具有更潛在的細(xì)胞毒性。已經(jīng)證實的能夠結(jié)合于Bim啟動子上的轉(zhuǎn)錄因子有FoxO3 (FKHRL1)、Myb和RUNX3。當(dāng)外界刺激能夠激活Rb時，其下游的E2F則結(jié)合于B

3、im的啟動子，同樣啟動其轉(zhuǎn)錄。TGF-β能通過Smad3來上調(diào)Bim的表達(dá)，同時TGF-β還能導(dǎo)致RUNX3結(jié)合于Bim的啟動子來上調(diào)Bim的轉(zhuǎn)錄。對Bim的翻譯后調(diào)控主要集中在JNK對Bim的磷酸化。此外Mcl-1與Bim的相互作用也能阻止Bim的誘凋亡作用。最近研究表明Bim還可通過蛋白質(zhì)降解途徑得到控制。通過被活化的ERK1/2磷酸化Bim EL的絲氨酸而導(dǎo)致Bim被蛋白酶體降解。 我們的實驗以pLexA-Bim L為ba

4、it，用酵母雙雜交的方法對胎腦pB42AD文庫進(jìn)行篩選以找出與Bim L相互作用的蛋白。在11個重復(fù)2次或2次以上的陽性克隆中，我們重點(diǎn)對生長因子受體結(jié)合蛋白10(Grb10)進(jìn)行了深入研究。通過生物信息學(xué)分析和多組織RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，在16種成人正常組織中，Grb10是廣泛表達(dá)的，尤其是在胰島素靶組織如：胰腺和骨骼肌中表達(dá)量最高，提示其在胰島素信號通路中起一定作用。在Bim L和Grb10的亞細(xì)胞共定位實驗中，我們發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)的B

5、im L在短時間內(nèi)以點(diǎn)狀分布于胞質(zhì)中，一定時間后會擴(kuò)散至整個細(xì)胞。而Grb10主要集中在細(xì)胞核周圍，與線粒體的分布相似。但通過線粒體特異性染料Mito-tracker對線粒體進(jìn)行染色后，我們發(fā)現(xiàn)Grb10和線粒體部分重疊，提示在過量表達(dá)情況下，Grb10很可能位于線粒體及其周圍質(zhì)膜以及胞質(zhì)中。而GFP-Bim L與Grb10-RFP有部分重疊，說明在空間上兩者也有相互作用的可能。利用免疫共沉淀實驗，我們確定了Bim L能與Grb10結(jié)合

6、，提示了Grb10在Bim L參與的凋亡途徑中可能有一定的作用。細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果表明，在Grb10過量表達(dá)的情況下，由Bim L介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡會在一定程度上得到抑制。因為Grb10中的SH2結(jié)構(gòu)域可以與磷酸化的酪氨酸受體特異性結(jié)合，我們根據(jù)Bim L蛋白序列中可能進(jìn)行磷酸化的酪氨酸位點(diǎn)進(jìn)行了定點(diǎn)突變。但細(xì)胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)，發(fā)生酪氨酸點(diǎn)突變的Bim L所誘導(dǎo)的凋亡被Grb10抑制的效果沒有受到明顯影響，說明Grb10與Bim L的結(jié)合可能通

7、過其它方式和/或部位進(jìn)行。為進(jìn)一步尋找Grb10與Bim L的相互作用區(qū)域，我們對Grb10對Bim L的不同異構(gòu)體Bim S、Bim α 2及Bimα 3誘凋亡的抑制作用進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)Grb10對Bim S和Bim α 3無明顯抑制效果，對Bim α 2有一定抑制作用。根據(jù)Bim L及其異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)域組成特點(diǎn)，實驗結(jié)果提示Grb10可能是通過DBD結(jié)構(gòu)域與Bim L結(jié)合。在磷酸化位點(diǎn)預(yù)測中，Bim L蛋白的Ser44和Thr56絲氨

8、酸和位于該結(jié)構(gòu)域中，我們分別檢測了Grb10對Ser44和Thr56點(diǎn)突變Bim L的抑制作用，結(jié)果無明顯抑制，實驗結(jié)果提示Grb10與Bim的相互作用與這兩個位點(diǎn)可能有關(guān)。但由于這兩個位點(diǎn)可能與ERK1/2和 JNK的磷酸化有關(guān)，還需進(jìn)行更深入研究來闡明這兩個位點(diǎn)在Grb10與Bim L的結(jié)合中的角色。此外，為進(jìn)一步尋找Grb10在胰島素受體和生長因子受體途徑之外的重要靶標(biāo)和配體，我們以pLexA- Grb10為bait，用酵母雙雜交

9、的方法對胎腦pB4-2AD文庫進(jìn)行篩選，我們發(fā)現(xiàn)與Grb10可能有相互作用的蛋白在細(xì)胞中的作用基本上都與促進(jìn)細(xì)胞增殖或阻止細(xì)胞凋亡有關(guān)。TCTP可調(diào)節(jié)Tsc- Rheb信號途徑，促進(jìn)細(xì)胞增殖和防止凋亡；PSMA 可協(xié)助磷酸化的Bim降解；ProT α阻止凋亡體的形成，負(fù)向調(diào)控caspase-9的活性，從而抑制細(xì)胞凋亡產(chǎn)生癌變。 Grb10與Bim L具有相互作用提示Grb10除了在胰島素受體途徑中的作用還參與由Bim介導(dǎo)的細(xì)胞凋