表皮生長(zhǎng)因子對(duì)牙囊細(xì)胞單核細(xì)胞趨化蛋白-1表達(dá)的影響.pdf

1、牙齒的萌出依賴(lài)于牙囊的存在及牙槽骨的吸收，而其中單核細(xì)胞進(jìn)入牙囊并在其中聚集是牙齒萌出的關(guān)鍵。牙齒萌出前，單核細(xì)胞遷入牙囊，并分化為破骨細(xì)胞吸收牙槽骨以形成牙齒的萌出通道。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)是單核細(xì)胞遷入牙囊的主要趨化分子，其基因表達(dá)的高峰期位于大鼠出生后第三天，與單核細(xì)胞遷入牙囊的時(shí)期相一致。 表皮生長(zhǎng)因子(EGF)是發(fā)現(xiàn)最早的生長(zhǎng)因子之一，分布于人體多種組織中，在上皮的生長(zhǎng)、分化、創(chuàng)傷的愈合過(guò)程中作用顯著。研

2、究表明，將EGF注射到新生小鼠體內(nèi)可以使切牙早熟性地萌出，因此EGF可能在牙齒萌出過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，但其具體的促萌機(jī)制尚不清楚。 本實(shí)驗(yàn)擬在通過(guò)培養(yǎng)大鼠牙囊細(xì)胞，觀察表皮生長(zhǎng)因子對(duì)牙囊細(xì)胞體外增殖的影響，并研究其與單核細(xì)胞趨化蛋白-1的關(guān)系，探討其在牙槽骨吸收過(guò)程中的作用，從而進(jìn)一步探討牙齒萌出的機(jī)理。 方法： 1.細(xì)胞培養(yǎng)：分離4～6天齡Wistar大鼠的牙囊組織，將組織塊放入a-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)

3、胞生長(zhǎng)至匯合點(diǎn)后傳代，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的3～4代細(xì)胞待用。 2.檢測(cè)EGF對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響：將生長(zhǎng)良好的牙囊細(xì)胞以2×104個(gè)/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后分別加入EGF(0.5、1、5、10、50ng/ml，與細(xì)胞共同孵育3～4天后，用MTT法對(duì)比觀察不同濃度的EGF對(duì)牙囊細(xì)胞增殖活性的影響。 3.檢測(cè)EGF對(duì)MCP-1表達(dá)的影響：將生長(zhǎng)良好的牙囊細(xì)胞接種于直徑70mm的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合點(diǎn)后，用無(wú)血清的

4、a-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)5h，再用10ng/ml濃度的EGF繼續(xù)孵育0、0.5、1、3、6h后終止培養(yǎng)，Trizol一步法分別提取總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)同一濃度的EGF作用不同時(shí)間后，牙囊細(xì)胞MCP-1 mRNA的表達(dá)變化。 結(jié)果： 1.牙囊組織培養(yǎng)24h后便可見(jiàn)少數(shù)細(xì)胞從組織周?chē)莱觯寿N壁型生長(zhǎng)，14～21天后細(xì)胞即可達(dá)單層匯合。細(xì)胞呈明顯的多形性，主要有兩種細(xì)胞形態(tài)，一種細(xì)胞呈梭形，另一種

5、細(xì)胞呈多角形，兩種細(xì)胞間雜在一起生長(zhǎng)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示細(xì)胞的波形蛋白表達(dá)陽(yáng)性，角蛋白表達(dá)陰性，表明細(xì)胞源自間充質(zhì)。 2.合適濃度的EGF對(duì)牙囊細(xì)胞的增殖有明顯的促進(jìn)作用。在濃度為1ng/ml時(shí)開(kāi)始顯效，5ng/ml時(shí)增高，10ng/ml時(shí)達(dá)到最高，與對(duì)照組比較有顯著差異。50ng/ml時(shí)增殖率開(kāi)始降低，且與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。 3.與10ng/ml EGF共同孵育0.5h，牙囊細(xì)胞中MCP-1mRNA表達(dá)開(kāi)始升高，3