miR-29a靶向Csda促進PC12凋亡的機制研究.pdf

1、MicroRNA（miRNA）是一種大小約21～23個堿基的單鏈小分子RNA，它由DNA非編碼區(qū)域轉錄，在進化中高度保守，其表達既具有時空特異性，也具有組織和細胞特異性。miRNAs通過與mRNA的3'端UTR序列互補而抑制其翻譯，因而廣泛的參與細胞的生長、分化、發(fā)育等生理病理過程。隨著對miRNA認識的不斷深入，發(fā)現(xiàn)miRNA在神經(jīng)系統(tǒng)的損傷過程中也起到了至關重要的作用。細胞凋亡是神經(jīng)損傷的重要形式，已有研究表明miRNA參與神經(jīng)細胞

2、的凋亡過程，Chen等發(fā)現(xiàn)miR-21在人類惡性腦膠質瘤中普遍高表達，通過抑制miR-21的表達膠質瘤細胞凋亡明顯增多，李朝輝等利用過氧化氫誘導PC12細胞模型，檢測到凋亡前后多個miRNA表達譜都發(fā)生了變化。
　　本實驗室前期通過miRNA芯片技術發(fā)現(xiàn)骨髓間充質干細胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)向神經(jīng)細胞分化后，miRNAs的表達譜發(fā)生明顯改變，其中miR-29a的表達量較分化前增

3、高最為明顯。之后通過慢病毒介導miR-29a在大鼠骨髓間充質干細胞中高表達，發(fā)現(xiàn)miR-29a有促進骨髓間充質干細胞的凋亡及抑制其增殖的作用[1]。也有研究表明，miR-29a靶向DNMT1，DNMT3a，DNMT3b，Mcl-1，YY1andCDK6[2-4]促進凋亡，它們也是依賴p53的方式誘導細胞凋亡。我們利用生物信息學技術，發(fā)現(xiàn)冷休克蛋白(Cold-ShockDead-boxproteinA，CSDA)也可能是miR-29a靶基

4、因，從而調節(jié)細胞的凋亡，但目前尚未有實驗證實。
　　在環(huán)境溫度發(fā)生明顯改變時，生物體會產生某種蛋白來調節(jié)機體功能，以適應溫度變化。比如，在環(huán)境溫度降低時機體會在低溫的刺激下產生一些蛋白來適應環(huán)境變化，該類蛋白統(tǒng)稱為“冷休克蛋白”(coldshockproteins，CSPs)[5]。迄今為止，CSPs已經(jīng)在微生物、植物及動物細胞中發(fā)現(xiàn)，而且已證實CSPs在核酸結構以及蛋白質結構上具有較高的同源性，且高度保守[6]。冷休克蛋白CSD

5、A是DeadBox蛋白家族中非常重要的一種蛋白，常溫下表達量極低，而在低溫時大量表達，具有RNA酶解旋活性，是核糖體結合蛋白，其功能與細胞增殖、分化、凋亡有關。
　　PC12細胞是大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤分化細胞株，具有神經(jīng)內分泌細胞的一般特征，被廣泛應用于神經(jīng)生理和神經(jīng)藥理學研究。本研究以慢病毒介導miR-29a前體在PC12細胞中高表達，通過H2O2誘導PC12凋亡為模型，探索mir-29a靶向CSDA基因促進細胞凋亡的作用，進一

6、步豐富mir-29a促進神經(jīng)細胞凋亡的理論。
　　目的：
　　建立高感染效率、穩(wěn)定的過表達miR-29a的PC12細胞株，探索miR-29a靶向CSDA基因促進細胞凋亡的作用，進一步豐富miR-29a促進神經(jīng)細胞凋亡的理論。
　　方法：
　　1.慢病毒的包裝。293T細胞復蘇和擴增，按照復能基因的慢病毒包裝試劑的操作步驟，分別包裝miR-29a前體表達病毒載體(Lvx-miR-29a-eGFP)、空白對照載體(L

7、vx-eGFP-control)，48h收獲病毒上清。
　　2.慢病毒感染PC12細胞及抗性篩選。感染前一天傳代PC12細胞至6孔板，加入200μl的病毒上清感染PC12細胞，48h后加入抗性培養(yǎng)基進行兩周的篩選。
　　3.實驗分組:miR-29a過表達組，空質粒對照組，200μmol/LH2O2+miR-29a過表達組，200μmol/LH2O2+空質粒對照組，200μmol/LH2O2+空白對照組。
　　4.流式細

8、胞術檢測各組細胞凋亡的變化，H2O2誘導PC12細胞10h后檢測各組細胞的凋亡率。
　　5.提取各組細胞的RNA，反轉錄為cDNA，real-timePCR檢測預測miR-29a調控靶基因表達的變化。提取各組細胞的蛋白，Westernblot檢測相應靶蛋白的變化。
　　6.統(tǒng)計學分析。采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行分析。獨立實驗重復3次，數(shù)值用樣本均數(shù)±標準差（(X)±S）表示，采用獨立樣本t檢驗比較兩組間差異，以α=0.

9、05為檢驗標準。
　　結果：
　　1.慢病毒包裝。293T細胞貼壁呈類圓形或多角形，排列整齊。包裝后48h收獲Lvx-miR-29a-eGFP和Lvx-eGFP-control病毒上清。
　　2.感染PC12細胞及抗性篩選。在病毒感染后的PC12細胞狀態(tài)略差，加入篩選培養(yǎng)基后未被病毒感染的細胞大量死亡，一周后存活的細胞開始形成克隆，篩選兩周后形成穩(wěn)定的細胞系，分別命名兩組細胞PC12-miR-29a，PC12-eGFP

10、，流式細胞術檢測感染率miR-29a過表達組為75.2％，空質粒對照組為69.8％。
　　3.流式細胞術檢測各組細胞的凋亡率，miR-29a過表達組凋亡率3.267±0.551％，空質粒對照組1.867±0.203％，miR-29a過表達促進PC12細胞凋亡(P＜0.05);200μmol/LH2O2+miR-29a過表達組的凋亡率為41.2±3.54％，300μmol/LH2O2+空質粒對照組12.77±0.35％，200μmo

11、l/LH2O2+空白對照組13.59±1.83％，在H2O2的誘導下空質粒對照組與空白對照組凋亡率的差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，而與空質粒組相比，miR-29a過表達時經(jīng)過H2O2誘導后PC12細胞的凋亡率顯著增加(P＜0.001)。
　　4.通過RT-qPCR檢測miR-29a下游靶基因，用相對定量的方法（2-ΔΔCt）計算miR-29a過表達組與空質粒對照組靶基因表達的的差異，miR-29a過表達時CSDA表達量下降(

12、miR-29a過表達組是空質粒對照組0.829倍，P＜0.001)，而Notch1，adam19，zfp91的表達量均升高（分別是miR-29a過表達組是空質粒對照組1.235倍，1.474倍，1.835倍，P＜0.001）。
　　5.當200μmol/LH2O2誘導10h后，各組CSDA表達量與相對應的未加H2O2組比較均顯著降低，其中H2O2+miR-29a過表達組CSDA是miR-29a過表達組的0.52倍，P＜0.001，

13、H2O2+空質粒對照組為0.67倍;在H2O2誘導凋亡后miR-29a過表達組CSDA表達量下降程度高于空質粒對照組（0.90倍，p＜0.05）。
　　6.WesternBlot結果顯示，H2O2誘導10h后，CSDA蛋白的表達量與H2O2陰性組相比明顯下降;而過表達miR-29a是CSDA蛋白的表達量與空質粒對照組相比也顯著降低。
　　結論：
　　1.miR-29a靶向抑制CSDA在PC12細胞中的表達，并促進細胞凋