中國(guó)MSM人群CRF59-01B的鑒定及其特點(diǎn)的研究.pdf

1、目的：
　　艾滋病是目前對(duì)人類社會(huì)威脅最大的傳染性疾病之一。盡管聯(lián)合抗病毒藥物已經(jīng)普遍應(yīng)用于艾滋病的治療，但由于HIV-1存在高水平的遺傳變異性，同時(shí)在人體免疫應(yīng)答和抗病毒藥物的作用下，病毒易出現(xiàn)高突變、高重組現(xiàn)象，從而使HIV在全球范圍內(nèi)經(jīng)歷了復(fù)雜的起源和流行過(guò)程。目前，HIV-1可以分為4個(gè)組，即M組(Main)、O組(Outlier)和N組(Non-M-Non-O)以及P組的，其中M組已經(jīng)進(jìn)化為十一種亞型和亞亞型，61種流行

2、重組型(Circulating RecombinantForms，CRFs)以及難以計(jì)數(shù)的獨(dú)特重組型（Unique Recombinant Forms，URFs），并且已有許多URFs轉(zhuǎn)變?yōu)镃RFs?，F(xiàn)階段，我國(guó)MSM(Men Who have Sex With Men，MSM)人群中流行的HIV-1毒株主要是CRF01_AE Cluster1和Cluster2、CRF07_BC Cluster3、B/B'亞型及CRF55_01B等多種

3、亞型共流行的局面，這種現(xiàn)象為不同亞型或流行重組型之間發(fā)生重組提供了機(jī)會(huì)。同時(shí)，MSM人群HIV疫情正處在快速上升階段，并且該人群是我國(guó)傳播的重要橋梁人群，已經(jīng)成為我國(guó)艾滋病防治的重點(diǎn)對(duì)象。了解和掌握我國(guó)MSM人群HIV-1毒株亞型的流行狀況及其進(jìn)化特點(diǎn)，是艾滋病防治及研究的基礎(chǔ)，并能為認(rèn)識(shí)HIV流行規(guī)律、設(shè)計(jì)艾滋病疫苗、研發(fā)診斷試劑及藥物研發(fā)提供科學(xué)的依據(jù)。
　　本研究于2008年至2013年在全國(guó)十一個(gè)省份收集920例MSM人群

4、HIV-1感染者血漿樣本，擴(kuò)增1.1 kb pol(pro-RT)區(qū)基因片段，通過(guò)pol(HXB2:2253-3318)基因片段進(jìn)化樹(shù)分析，對(duì)疑似流行重組型的樣本，采用5'半分子和3'半分子兩段法單基因擴(kuò)增并直接測(cè)序的方法(Single Genome Amplifieation andSequeneing，SGA/S)獲得血漿病毒HIV幾乎近全長(zhǎng)基因(Near Full Length Genome，NFLG)序列，確認(rèn)該人群中存在一新型

5、的重組株:CRF59_01B。從病毒全基因組水平分析CRF59_01B的重組模式;采用時(shí)間進(jìn)化分析(BEAST v.1.6.0)，分析其不同片段的起源時(shí)間;結(jié)合流行病學(xué)數(shù)據(jù)，推算其流行規(guī)模，明確其在我國(guó)MSM人群總體流行狀況，并分析其對(duì)未來(lái)我國(guó)MSM人群HIV流行可能的影響，從而為我國(guó)HIV-1感染的預(yù)防、診斷、監(jiān)測(cè)和治療提供重要的數(shù)據(jù)支持。
　　材料和方法：
　　一、研究對(duì)象
　　2008年至2013年全國(guó)11個(gè)省份

6、招募920例MSM人群HIV-1感染者，吉林8例;遼寧263例;北京163例;山東42例;江蘇49例;上海26例;安徽136例;河南58例;湖南68例;廣東40例;云南67例。HIV感染者的EDTA抗凝血漿樣本均由上述各省疾病控制中心采集，同時(shí)收集HIV感染者的流行病學(xué)資料。血漿樣本于-80℃.凍存。所有患者均簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)過(guò)了中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
　　二、血漿樣本RNA的提取
　　使用140ul

7、EDTA抗凝外周靜脈血血漿，采用QIAamp RNAMini試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)標(biāo)準(zhǔn)方法，快速提取HIV-1全基因組RNA60μl。將純化后的RNA置-80℃保存?zhèn)溆没蜻M(jìn)行一下步試驗(yàn)。
　　三、pol區(qū)擴(kuò)增及NFLG逆轉(zhuǎn)錄
　　1.1 kb pol區(qū)擴(kuò)增體系基于TaKaRaTaqTMDR001 AM一步法說(shuō)明;NFLG逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系基于SuperScript(R)Ⅲ Reverse Transcriptase Kit（i

8、nvitrogen）說(shuō)明書(shū)，分5'半分子和3'半分子兩段逆轉(zhuǎn)錄，分別獲得5'半分子和3'半分子cDNA。
　　四、SGA方法Nested-PCR擴(kuò)增NFLG
　　本實(shí)驗(yàn)采用Nudease Free Water倍比稀釋cDNA(1∶3;1∶9;1∶27可適當(dāng)優(yōu)化)的方法，每個(gè)稀釋度均做8個(gè)平行孔，進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增，直至擴(kuò)增陽(yáng)性孔少于3個(gè)。根據(jù)Possion分布，當(dāng)陽(yáng)性率小于25％時(shí)，即可認(rèn)為每個(gè)孔為單一模板擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)

9、增體系基于Platinum(R)Taq DNA Polymerase High Fidelity Kit（Invitrogen）說(shuō)明書(shū)，分兩段套式擴(kuò)增HIV-1 cDNA全長(zhǎng)基因組序列。
　　五、測(cè)序及序列分析
　　選取每個(gè)樣本的第二輪產(chǎn)物各50ul，由北京博邁德測(cè)序公司，使用Primerwalking測(cè)序。測(cè)得的序列用Vector NTI8.0軟件包中的ContigExpress組件將每個(gè)樣本NFLG的5'半分子和3'半分

10、子序列拼接為一個(gè)完整的近似全長(zhǎng)基因組。用Bioedit(vision3.3)對(duì)拼接序列進(jìn)行編輯、校正、合并樣本序列和參考毒株序列為一個(gè)隊(duì)列。用MEGA5.1軟件以Kimura雙參數(shù)方法構(gòu)建pol和全長(zhǎng)Neighbor-Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。使用HIV Database的在線軟件RIP: RecombinantIdentification Program和jpHMM: jumping profile Hidden Markov Mod

11、el(www.hiv.lanl.gov)初步分析基因序列的重組狀況。使用軟件Simplot(v3.5.1)對(duì)重組毒株的斷點(diǎn)進(jìn)行準(zhǔn)確定位。
　　六、CRF59_01B最近共同祖先的推斷
　　使用Bayesian Evolution Analysis Sampling Trees(BEAST v1.5.4)軟件推斷最近共同祖先形成時(shí)間(tMRCA)。用BioEdit5.0將比對(duì)好的序列文件轉(zhuǎn)換為.nex文件，用BEAUTi v1

12、.5.4軟件打開(kāi).nex文件，選擇運(yùn)行參數(shù)，Markov chain Monte Carlo(MCMC)運(yùn)算:2×108次，生成.xlm文件。運(yùn)行BEAST v1.5.2，打開(kāi)生成的.xml文件，運(yùn)算并保存結(jié)果至.log文件和.trees文件。用Tracer v1.4打開(kāi).log文件，分析tMRCA值;用FigTree1.3.1打開(kāi)新生的.tree文件，得到MCC樹(shù)。
　　結(jié)果：
　　一、我國(guó)MSM人群HIV-1亞型分布

13、r>　　通過(guò)構(gòu)建1.1 kb pol進(jìn)化樹(shù)分析，本研究獲得的920例樣本中共發(fā)現(xiàn)六種明確的病毒亞型，占到總亞型的96.9％，CRF01_AE占57.9％(533/920)，CRF07_BC占24.2％(233/920)，B亞型占11.0％(101/920)，B'亞型占1.2％(11/920)，CRF08_BC占0.4％(4/920)，CRF33_01B占0.1％(1/920)，CRF55_01B占2.1％(19/920);而且，CRF0

14、1_AE又進(jìn)一步分為兩簇:Cluster1和Cluster2，而大部分的CRF07 BC也獨(dú)立成簇，為我國(guó)MSM人群的Cluster3。各種URFs28例，占3.1％(28/920)。
　　二、28例URFs重組情況的研究
　　使用Mega5.0構(gòu)建28例URFs序列Neighbor-Jioning基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)在28例URFs當(dāng)中，有6例明顯在一個(gè)進(jìn)化簇上，Simplot分析皆為CRF01AE/B，重組斷點(diǎn)幾乎一致。

15、本實(shí)驗(yàn)獲得6條1.1 kb pol CRF01_AE/B分別通過(guò)5'半分子和3'半分子SGA方法，擴(kuò)增測(cè)序得到5條NFLG，全長(zhǎng)基因序列為9kb左右。利用MEGA(V5.0)軟件Neighbor-joining tree法，構(gòu)建5條近似全長(zhǎng)序列進(jìn)化樹(shù)，5條序列仍明顯獨(dú)立成簇，各患者之間未有明確的流行病學(xué)關(guān)聯(lián)。依據(jù)HIV Database序列命名原則，本研究發(fā)現(xiàn)的5條NFLG及1條1.1 kb pol序列命名為CRF59_01B。且本研究

16、結(jié)果已被Genebank和HIV Database數(shù)據(jù)庫(kù)收錄。
　　三、我國(guó)MSM人群CRF5901B重組斷點(diǎn)分析
　　運(yùn)用Simplot軟件進(jìn)行全基因組精確重組斷點(diǎn)斷位。通過(guò)作圖發(fā)現(xiàn)，CRF59_01B共有四個(gè)重組斷點(diǎn)，四個(gè)重組斷點(diǎn)分別位于pol區(qū)的2570和2719(相對(duì)于HXB2位置)以及vpu-env區(qū)的6149和8244(相對(duì)于HXB2位置)，把整個(gè)CRF59_01B全基因組分成五個(gè)部分，其中Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ部分為CRF

17、01_AE，Ⅱ、Ⅳ部分為B，即:Ⅰ(HXB2:790-2569)=CRF01_AE;Ⅱ(HXB2:2570-2718)=B;Ⅲ(HXB2:2719-6148)=CRF01_AE;Ⅳ(HXB2:6149-8243)=B;Ⅴ(HXB2:8244-9600)=CRF01_AE。整個(gè)基因組序列又以CRF01_AE為骨架，分別在pol區(qū)和vpu-env插入部分B亞型毒株序列。
　　四、CRF59_01B全基因組各亞區(qū)(Subregion)來(lái)

18、源的研究
　　依據(jù)Simplot軟件對(duì)CRF59_01B重組斷點(diǎn)的精確劃分結(jié)果，分別對(duì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ構(gòu)建Subregion進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ部分的CRF01_AE亞型親本來(lái)源于泰國(guó)CRF01_ AE，并非我國(guó)MSM人群中所特有的CRF01_AE Cluster1和Cluster2;而Ⅱ、Ⅳ部分的B亞型親本來(lái)源于早期MSM人群中流行的歐美B亞型，不是中原地區(qū)有償采供血爆發(fā)流行的B'亞型。
　　五、CRF59_01B起源

19、時(shí)間及傳入MSM人群時(shí)間的推算。
　　運(yùn)用BEAST程序，我們分別分析CRF59_01B的CRF01_AE亞型成分和B亞型成分起源時(shí)間。研究結(jié)果表明，CRF01_AE亞型成分和B亞型起源時(shí)間幾乎一致，分別為2000.8(1998.0-2002.9)和2001.2(1995.4-2005.8)，可以推測(cè)CRF59_01B起源時(shí)間大約為2001年，而后開(kāi)始在MSM人群流行傳播。
　　結(jié)論：
　　一、我國(guó)MSM人群有多種HI

20、V-1毒株流行，主要流行毒株為CRF01_AEC luster1和Cluster2、CRF07_BC、B/B'、CRF55_01B、CRF59_01B及各種URFs。其中，B/B'、CRF55_01B、CRF59_01B及各種URFs呈現(xiàn)低流行趨勢(shì)。
　　二、首次在我國(guó)MSM人群中鑒定出一株CRF59_01B。
　　三、明確了CRF59_01B在我國(guó)MSM人群流行規(guī)模及流行率:0.7％，并推算出其在我國(guó)MSM人群中的起源時(shí)間