TAK1siRNA基因沉默對RA滑膜細胞ATF2表達的影響.pdf

1、目的：
　　 要求培養(yǎng)滑膜原代細胞,制備良好的轉(zhuǎn)染劑,然后將轉(zhuǎn)染液導(dǎo)入滑膜細胞內(nèi),抑制人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細胞TAK1基因,給予體外刺激因素干預(yù),檢測ATF2表達量,為人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療及研究提供基礎(chǔ)及依據(jù)。
　　 方法：
　　 人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細胞體外實驗培養(yǎng),收集病人膝關(guān)節(jié)置換術(shù)、髖關(guān)節(jié)置換術(shù)中的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人病變的類風(fēng)濕性滑膜組織,采用酶消化法進行體外滑膜細胞的培養(yǎng),在培養(yǎng)類風(fēng)濕滑膜細胞的過程中

2、,采用n型膠原酶及胰酶對標(biāo)本進行消化體外培養(yǎng),倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀念及細胞數(shù)量。定制sirNA轉(zhuǎn)染試劑及轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)劑,制備可靠的特異性siRNA,將培養(yǎng)的類風(fēng)濕細胞分組,采用體外的方式將轉(zhuǎn)染劑導(dǎo)入需要檢測的細胞內(nèi),抑制TAK1基因,然后給予刺激因素刺激完畢后,利用Elisa檢測轉(zhuǎn)錄因子ATF2的表達情況。
　　 結(jié)果：
　　 該實驗四例患者的滑膜細胞標(biāo)本均采用體外消化培養(yǎng)法成功培養(yǎng),平均傳代至3～5代,細胞生長狀態(tài)較

3、好,比較穩(wěn)定,大約傳至第7代時細胞生長減慢,出現(xiàn)老化狀態(tài)。免疫組化鑒定滑膜細胞均一地表達Vimetin(>95%)、表明所培養(yǎng)的細胞是滑膜成纖維細胞。設(shè)計的4組標(biāo)本分別是實驗組轉(zhuǎn)染TAK1siRNA、陽性對照組轉(zhuǎn)染GAPDHsiRNA、陰性對照組轉(zhuǎn)染堿基錯配siRNA、未轉(zhuǎn)染細胞組,給予刺激因素刺激生長,經(jīng)檢測,實驗組與對照組相比轉(zhuǎn)錄因子ATF2含量有明顯的差異,呈現(xiàn)出組間差異,這表明,通過抑制TAK1可降低ATF2的轉(zhuǎn)錄活性,并可能進