AP3B1基因在雌性生殖和子宮發(fā)育中作用的研究及CRISPR-CAS9技術(shù)在小鼠基因定點(diǎn)敲除中的應(yīng)用.pdf

1、第一部分:AP3B1基因在雌性生殖和子宮發(fā)育中作用的研究
　　受社會(huì)快速發(fā)展給人們生活環(huán)境帶來(lái)的負(fù)面影響，不孕不育的發(fā)病率越來(lái)越高，據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)，不孕不育癥將成為21世紀(jì)的第三大疾病，僅次于腫瘤和心腦血管病。在眾多的不孕不育患者中女性子宮發(fā)育不良是主要病因之一，且尚無(wú)有效的治療方法。我們的研究發(fā)現(xiàn)pearl(pe)雌鼠存在典型的幼稚子宮現(xiàn)象，可以作為研究子宮發(fā)育不良的動(dòng)物模型。pe小鼠是AP3B1基因突變引起的HPSⅡ動(dòng)物模

2、型。HPS是一種常染色體隱性遺傳病，主要的臨床癥狀有肺部纖維化、出血、結(jié)腸炎等，目前在HPSⅡ病人和pe小鼠中尚無(wú)生殖能力下降的報(bào)道。
　　在本部分論文中，我們依次在整體、器官、以及細(xì)胞分子水平對(duì)pe小鼠的生殖系統(tǒng)進(jìn)行了全面檢測(cè)，并對(duì)AP3B1基因?qū)е聀e雌鼠子宮發(fā)育不良的原因進(jìn)行了深入探索。通過(guò)大規(guī)模交配實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比，pe雌鼠的產(chǎn)仔數(shù)顯著降低，受孕幾率略微降低。進(jìn)一步通過(guò)對(duì)各個(gè)年齡段pe雌鼠進(jìn)行器官組織水平分析，

3、我們發(fā)現(xiàn):當(dāng)發(fā)育到一個(gè)月時(shí)，pe雌鼠開始出現(xiàn)子宮發(fā)育不良的明顯特征，發(fā)育到三個(gè)月時(shí)pe雌鼠表現(xiàn)出顯著的幼稚子宮的特征;而在幼鼠時(shí)這一現(xiàn)象并不明顯。pe雌鼠的卵巢沒有明顯的發(fā)育異常，但其超排卵數(shù)量顯著降低，雌激素含量與B6相比沒有顯著差異。分子蛋白水平分析發(fā)現(xiàn):pe雌鼠的子宮發(fā)育的關(guān)鍵基因Hoxa10、Hoxa11、Wnt5a表達(dá)明顯降低;WesternBlot分析證實(shí)子宮發(fā)育過(guò)程重要的通路蛋白β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)量顯著高于B

4、6，在細(xì)胞膜上表達(dá)量顯著低于B6，我們認(rèn)為受AP3B1基因突變影響，β-catenin的運(yùn)輸過(guò)程發(fā)生障礙，導(dǎo)致其在細(xì)胞質(zhì)中大量積累。
　　綜上所述，pe雌鼠表現(xiàn)出明顯的子宮發(fā)育不良的特征，是研究幼稚子宮的良好的動(dòng)物模型，AP3B1基因突變引起子宮發(fā)育不良的原因很可能是AP3蛋白復(fù)合體的缺失影響了PCP-2和β-catenin的膜質(zhì)定位，進(jìn)而導(dǎo)致了子宮發(fā)育中重要的調(diào)控通路Wnt和Hox異常。對(duì)相關(guān)途徑的深入探究將加深我們對(duì)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的

5、認(rèn)識(shí)，同時(shí)可以為臨床不孕不育研究提供新的思路。
　　第二部分:CRISPR-CAS9技術(shù)在小鼠基因定點(diǎn)敲除中的應(yīng)用
　　對(duì)基因組中特定位點(diǎn)進(jìn)行修飾的實(shí)驗(yàn)手段稱為基因組編輯。它在研究基因的功能和基因修復(fù)以及細(xì)胞替代治療上有廣泛的應(yīng)用前景。CRISPR-CAS9技術(shù)作為一門新興的基因修飾方法，憑借其眾多的優(yōu)勢(shì)正逐步成為傳統(tǒng)基因編輯方法強(qiáng)有力的替代者。2013年CRISPR-CAS9技術(shù)在小鼠基因定點(diǎn)敲除中得到了前所未有的普及和發(fā)

6、展，本部分論文的目的在于搭建小鼠受精卵顯微注射平臺(tái)，并在此基礎(chǔ)上初步探索CRISPR-CAS9技術(shù)在小鼠基因定點(diǎn)敲除中的應(yīng)用。
　　小鼠受精卵顯微注射平臺(tái)主要由四部分組成，分別為受精卵的收集，受精卵的處理，受精卵的顯微注射和二細(xì)胞期胚胎移植。我們通過(guò)大量的重復(fù)實(shí)驗(yàn)針對(duì)上述四個(gè)步驟摸索了一套合適的實(shí)驗(yàn)條件，包括受精卵消化用的透明質(zhì)酸酶濃度最佳為0.3mg/ml，受精卵收集的時(shí)間設(shè)在下午13:00最合適，胚胎移植的假孕雌鼠品系最好用C

7、D1。最終我們胚胎移植的多只CD1雌鼠成功生育，說(shuō)明顯微注射平臺(tái)初步建設(shè)完成。
　　為了利用CRISPR-CAS9技術(shù)在我們建設(shè)的顯微注射平臺(tái)上進(jìn)行小鼠基因敲除工作，我們選擇了附睪特異基因Teddm1和serpinalf,由于時(shí)間關(guān)系，我們完成了上述基因的靶點(diǎn)設(shè)計(jì)工作，后續(xù)的gRNA的構(gòu)建和Cas9RNA的制備工作正在進(jìn)行中。相信在未來(lái)CRISPR/Cas技術(shù)會(huì)在基因修飾領(lǐng)域得到全面的發(fā)展，并有效地推動(dòng)基因功能的研究進(jìn)程。