CRISPR-Cas9介導綠色熒光蛋白基因在牛NANOG位點定點整合的研究.pdf

1、Nanog是一種在內(nèi)細胞團、原始生殖細胞以及ESCs表達的新轉錄因子。屬于ANTP類，NK家族基因。在胚胎發(fā)育及干細胞分化中有著重要作用。
　　本研究針對牛的NANOG基因的一段序列設計特異識別的gRNA并構建了CRISPR/Cas9表達載體。實驗選用的骨架載體具有新霉素抗性基因(Neor)表達框架和報告基因EGFP，構建了針對CRISPR/Cas9切割位點的同源打靶載體pNlrkt。其外源基因為EGFP，在報告基因的上游包含長8

2、01bp的5'同源臂，在(Neor)表達框架下游包含長370bp的3'同源臂。限制性酶切片段分析和序列測定分析的結果表明，所構建的pNlrkt載體正確。
　　將構建成功的載體pNlrkt用脂質體轉染方法導入到人胚胎干細胞MelI細胞系中，經(jīng)24h培養(yǎng)后，熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，結果表明pNlrkt載體可指導EGFP使其在人胚胎干細胞中發(fā)光。
　　為了獲得EGFP基因在NANOG基因位點定點整合的細胞系，檢測CRISPR/

3、Cas9介導的外源基因整合效率，通過電轉染的方法將CRISPR/Cas9: pNlrkt導入到秦川牛胎兒成纖維細胞中，經(jīng)過G418篩選、口吸管和流式細胞儀挑單克隆細胞、單克隆細胞培養(yǎng)擴增獲得69株細胞系，最終經(jīng)3'和5'同源臂跨臂PCR檢測，最終獲得4株外源基因定點整合的細胞系。
　　本研究最終獲得4株NANDG定點整合細胞系，這些細胞系為后續(xù)進一步研究NANOG在秦川牛早期胚胎發(fā)育中的作用以及提高胚胎發(fā)育率促進畜牧業(yè)發(fā)展提供了途