CRISPR-Cas9介導(dǎo)DGAT1基因在小鼠MSTN位點(diǎn)定點(diǎn)整合研究.pdf

1、MSTN(Myostatin肌肉生長抑制素)，是骨骼肌生長發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子，敲除該基因使其缺失后，肌肉量增加。DGAT1是甘油?；D(zhuǎn)移酶(DiacylgycerolAcyltransferase，DGAT)的一種，它與脂肪的合成與分解代謝、脂類在組織中的沉積密切相關(guān)。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，通過gRNA的介導(dǎo)，識別DNA的特定位點(diǎn)，從而引導(dǎo)Cas9蛋白進(jìn)行特異性地切割，DNA斷裂后會啟動(dòng)兩種修復(fù)機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)基因的敲除或敲入

2、。本實(shí)驗(yàn)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，獲得了敲減MSTN的同時(shí)定點(diǎn)敲入DGAT1的陽性細(xì)胞，希望為生產(chǎn)產(chǎn)肉量多肉質(zhì)鮮美的轉(zhuǎn)基因大動(dòng)物提供依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.成功構(gòu)建了CRISPR/Cas9系統(tǒng)中關(guān)鍵載體gRNA及打靶載體CAG-DGAT1
　　本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了CRISPR/Cas9系統(tǒng)中針對小鼠MSTN基因的gRNA，通過Surveyor突變檢測試劑盒進(jìn)行了檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在該gRNA的引導(dǎo)

3、下Cas9可以高效的對DAN進(jìn)行切割。本實(shí)驗(yàn)還構(gòu)建了打靶載體CAG-DGAT1，采用PCR、酶切和測序的方式進(jìn)行鑒定，證明載體準(zhǔn)確無誤。
　　2.小鼠成纖維細(xì)胞與小鼠胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)染方式的選擇優(yōu)化
　　本實(shí)驗(yàn)采取了電轉(zhuǎn)染和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染兩種方式對兩種不同的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于小鼠成纖維細(xì)胞電轉(zhuǎn)染的效率明顯高于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。而小鼠胚胎干細(xì)胞用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的效果明顯好于電轉(zhuǎn)。
　　3.對轉(zhuǎn)DGAT1基因細(xì)胞的檢測

4、r>　　通過跨同源臂檢測的方法證明DGAT1基因已定點(diǎn)整合到細(xì)胞的MSTN位點(diǎn)。為了驗(yàn)證基因插入后的效果，通過實(shí)時(shí)定量PCR分別檢測了目的基因及脂肪代謝相關(guān)基因和與肌肉發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)陽性細(xì)胞中DGAT1的表達(dá)量是對照組的32.76倍。隨著DGAT1含量的提高，脂肪代謝有關(guān)基因的表達(dá)有不同程度的上調(diào)，乙酰輔酶A羧化酶上調(diào)1.58倍，脂肪酸結(jié)合蛋白4上調(diào)7.11倍，DGAT2上調(diào)2.93倍。說明DGAT1的上調(diào)對促進(jìn)了