兩種基因定點敲除技術TALEN和CRISPR在擬南芥中的應用.pdf

1、近年來，隨著多種特異性核酸酶的開發(fā)和應用，基因組編輯技術的高效性和準確性顯著提高。該類技術的廣泛應用使得基因功能的研究、遺傳性疾病的治療以及農業(yè)生物技術的發(fā)展等各個領域取得了突破性進展。
　　TALEN(transcription activator like effectors nuclease)和CRISPR(clusteredregμlatory interspersed short palindromic repeat)是

2、兩種目前最有效的基因定點敲除新技術。這兩種體系中都含有人工重組的核酸內切酶，可以對DNA進行靶向切割，造成DNA雙鏈斷裂(DSB)，進而引發(fā)非同源末端連接(NHEJ)或同源重組(HR）等DSB修復途徑。NHEJ修復過程中極易發(fā)生堿基的缺失、插入和置換，TALEN和CRISPR就是利用這一特性，實現(xiàn)基因的靶向敲除。
　　三個擬南芥基因IAA2、SIRT2和SAUR41的功能和作用機理是本實驗室的重要研究內容，為了獲得功能完全喪失的突

3、變體，以深化先前的研究，我們設計和構建了針對這三個基因的TALEN和CRISPR定點敲除體系。另一方面，在農桿菌介導的擬南芥花序直接轉基因技術中，TALEN和CRISPR的應用還不夠成熟，本文也嘗試在方法學上作一些探討。
　　首先，我們獲得了三個基因兩種敲除技術共六大組合的轉基因擬南芥T1代株系。接著，我們利用T7核酸內切酶識別并切割DNA錯配的原理，在T1代株系的葉片細胞中檢測體細胞突變。另外，我們還從T1代株系誘導愈傷組織，在

4、愈傷組織細胞中檢測體細胞突變。最后，我們在T2代株系和愈傷組織再生植株中篩查種系突變。
　　結果表明:(1)TALEN體系中，IAA2基因的體細胞突變率最高，愈傷組織細胞中可達31.6％; CRISPR體系中，SAUR41基因的體細胞突變率最高，葉片細胞中可達16.1％;(2)TALEN和CRISPR相比，前者造成的DNA缺失片段更長，可能參與的DSB修復機制更復雜;(3)葉片細胞和愈傷組織細胞相比，后者的基因突變率高2倍左右，利