TALEN和CRISPR技術在弓形蟲致病機制研究中的應用.pdf

1、隨著分子生物學技術的發(fā)展，人們對于基因的研究越來越透徹，基于基因的遺傳改造技術也取得了飛速的發(fā)展。從ZFN到TALEN再到后來的CRISPR技術，短短八年時間，DNA靶向技術便經歷了幾次大的變革。由此也引發(fā)了以弓形蟲為模式生物的頂復門寄生蟲基因研究的技術突破。弓形蟲是一種專性胞內寄生的原蟲，可引起嚴重的人畜共患寄生蟲病，給人類的生育健康和畜牧業(yè)的發(fā)展帶來嚴重的危害。盡管關于弓形蟲的基礎研究已經取得了一定的成果，但在致病機制等方面仍知之甚

2、少。這些新興的遺傳操作技術為此帶來了突破的機會。
　　本研究首先應用TALEN技術針對入侵的關鍵因子RON2進行移碼突變，隨后以DNA疫苗的形式對其各功能區(qū)進行免疫保護性驗證;然后利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)比較分析GRA7，ROP17，ROP18在本地分離株(T.gHB1)的毒力作用;構建了調控弓形蟲基因轉錄的CRISPR-dCas9抑制表達系統(tǒng)。
　　1.TALEN技術介導的RON2的功能失活及RON2各功能域的免疫保

3、護力驗證
　　根據(jù)RON2基因序列設計DNA靶點識別域，并構建相應的TALEN質粒;轉染后根據(jù)RFP和GFP雙熒光信號對蟲體進行篩選驗證，以PCR和測序的方法鑒定靶點結合域的序列突變。結果顯示TALEN質粒成功誘導了RON2的移碼突變，但由于RON2的功能缺失導致蟲體入侵受阻，未分離到單克隆蟲株。對RON2基因功能域進行分析，分別構建了三個pcDNA3.1-RON2(1/2/3)真核表達質粒，以100μg/只小鼠的劑量分別于0d,

4、14 d，28 d，42 d進行免疫。結果顯示，RON2-1/2/3均刺激小鼠產生高水平的IFN-γ，但僅有RON2-3免疫組對小鼠有16.7％的免疫保護力。結果證實，RON2的胞外結構域可作為疫苗候選分子用于弓形蟲疫苗的研究。
　　2.CRISPR-Cas9系統(tǒng)介導的HB1弓形蟲毒力相關因子的敲除
　　首先，分別構建識別GRA7，ROP17，ROP18的CRISPR-Cas9-sgRNA質粒和用于同源重組修復的質粒（含GF

5、P、DHFR*或CAT篩選標記）;轉染后的蟲體經診斷PCR、Western-blot等鑒定最終獲得ΔGRA7、ΔROP17、AROP18、ΔGRA7ΔROP17、ΔGRA7ΔROP18五個敲除蟲株;通過空斑實驗和小鼠攻蟲實驗驗證敲除蟲株的生物學特性。最終空斑結果表明五個突變株在體外培養(yǎng)過程中與野生型沒有生長速度上的明顯差異;攻蟲結果顯示ΔGRA7、ΔROP17、ΔROP18表現(xiàn)出不同程度的毒力下降，ΔGRA7ΔROP17、ΔGRA7ΔR

6、OP18表現(xiàn)出與ΔROP17、ΔROP18相似的毒力下降。結果表明GRA7，ROP17和ROP18等毒力因子在HB1株中發(fā)揮重要的毒力作用，與RH株致病模式存在差異。
　　3.基于CRISPR-dCas9系統(tǒng)對弓形蟲SAG1啟動子的抑制調控
　　利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)以SAG1P∷RFP-SAG13'替代UPRT構建一株穩(wěn)定表達RFP的弓形蟲蟲株;通過缺失切割活性的dCas9和轉錄調節(jié)因子（KRAN）來構建CRISP

7、R-dCas9抑制系統(tǒng);構建多個識別SAG1啟動子的CRISPR-dCas9質粒進行轉錄調控試驗，通過熒光鏡檢的方法對SAG1的轉錄活性進行評價。結果顯示，sgRNA結合在SAG1啟動子-316至-297 bp處，pCRISPR-dCas9-KRAB-sgSAG1的結合可實現(xiàn)對弓形蟲內源基因SAG1和外源基因RFP的顯著抑制。
　　本研究通過TALEN技術誘導了RON2的移碼突變，證實了RON2不可替代，并通過DNA疫苗實驗驗證了